En 1508, le maître d’œuvre, Jehan Texier dit Jehan de Beauce, réalise la façade de l’abbatiale de la Trinité.
Cet embrasement sculpté est un des chefs-d’œuvre de l’art gothique flamboyant.
Le clocher de l’église constitue aussi un édifice exceptionnel construit au xiie siècle. .
Christophe Marion à l’Assemblée nationale le 16 mars 2023. • © France 3 Centre-Val de Loire
Une déclaration qui s’inscrit dans la continuité de celles émanant notamment de la gauche, le député EELV de Tours Charles Fournier qualifiant la manœuvre de « déni de démocratie« . Sauf que Christophe Marion, lui, est un député Renaissance, le parti présidentiel. Et au sein de son mouvement, il n’est même pas frondeur :
J’ai assumé ce texte, pour moi c’est un bon texte. Ce n’est pas une réforme populaire. Il méritait, ce texte, d’aller au vote à l’Assemblée nationale.
Christophe Marion, député Renaissance de Loir-et-CherComme elle l’a expliqué devant l’Assemblée ce jeudi, Élisabeth Borne a préféré déclencher le 49.3 (qui prend le risque d’exposer son gouvernement à une motion de censure) que de passer par un vote des députés. Vote qui aurait été, au mieux pour le gouvernement, très serré selon les dernières estimations.
Mais pour Christophe Marion, c’est un texte qu’il fallait faire passer par la case vote, « même s’il était perdu, et en tirer les conséquences, soit retirer le texte, soit le retravailler pour obtenir une majorité« . Cette position, il assure la partager avec d’autres députés de son groupe, « tout aussi déçus » que lui.
Source : Réforme des retraites : le 49.3 est un « aveu d’échec », même pour des députés de la majorité
Pascal ForeauL utilisation du 49_3 c est changer la V République et l équilibre entre les pouvoirs. Un President de la République gouverne par son Premier ministre avec un parlement et des institutions ce n est pas le mandat d un dictateur decidé par le peuple pour répondre à une crise ou à une période de troubles.
RÉGIMES DE BASE DE SÉCURITÉ SOCIALE (HORS BRANCHES FAMILLE ET AUTONOMIE)
PAR Mme Marina FERRARI, députée l16b0771_rapport-avis
Légende : sont grisés les régimes spéciaux déjà fermés ou dont la fermeture est envisagée par le PLFRSS pour 2023.
Note n° 1 (direction de la sécurité sociale) : pour simplifier la lecture, les tableaux reposent sur la notion de branche, non de risque. Par conséquent, les prestations effectivement prises en charge peuvent varier entre les régimes identifiés comme disposant d’une même branche. Il en résulte aussi que le risque d’invalidité est conventionnellement inclus dans la branche maladie pour les personnes avant l’âge légal de départ à la retraite et dans la branche vieillesse après.
Certains régimes d’assurance vieillesse servent des pensions d’invalidité ou des rentes (pensions de réforme). Lorsque ce sont les seules prestations incluses dans les comptes de la branche, la case est notée du symbole ○. Lorsque le régime assure la couverture des risques correspondant à la branche, la case est notée du symbole ●. Lorsque les risques ne sont pas couverts par ce régime, la case est vide. Par exemple, les fonctionnaires civils de l’État sont assurés au régime général au titre de l’assurance maladie. Ils sont affiliés à un régime spécial pour les branches vieillesse et AT-MP.
Note n° 2 : manquent le régime de l’Office de radio-télévision française (ORTF), fermé en 1936, et celui CESE.
Légende : sont grisés les régimes spéciaux déjà fermés ou dont la fermeture est envisagée par le PLFRSS pour 2023.
Source : annexe 1 du PLFSS pour 2023.
Si cette ordonnance fondatrice proclame que « l’organisation de la sécurité sociale assure dès à présent le service des prestations prévues par les législations concernant […] l’allocation aux vieux travailleurs salariés » et que « des ordonnances ultérieures procéderont à l’harmonisation desdites législations et pourront étendre le champ d’application de l’organisation de la sécurité sociale à des catégories nouvelles de bénéficiaires » ([20]), la loi a précisé, via ce qui est aujourd’hui l’article L. 711-1 du code de la sécurité sociale, que « parmi celles jouissant déjà d’un régime spécial le 6 octobre 1945, demeurent provisoirement soumises à une organisation spéciale de sécurité sociale, les branches d’activités ou entreprises énumérées par un décret en Conseil d’État » ([21]).
● La rapporteure pour avis soutient les objectifs du Gouvernement en termes d’équité, d’universalité et de lisibilité du système de retraite : l’existence de certains des régimes spéciaux chargés de l’assurance vieillesse ne paraît plus pertinente, compte tenu à la fois du rapprochement considérable des conditions de travail des assurés qui en relèvent avec ceux relevant du régime général ou de ceux déjà alignés sur lui et du déséquilibre démographique qui les caractérise parfois, obligeant l’État à compenser leur déficit.
En matière de retraite, tel est le cas des régimes des industries électriques et gazières (CNIEG), lesquelles couvrent singulièrement le personnel des sociétés Électricité de France (EDF), Engie, Enedis et de leurs réseaux de transport (RTE, GRDF, etc.), de la Régie autonome des transports parisiens (RATP), des clercs et employés de notaire (CRPCEN), de la Banque de France et des membres du Conseil économique, social et environnemental (CESE).
Par exemple, les cotisations de la RATP représentaient 489 millions d’euros en 2021, tandis que la dotation de l’État atteignait 737 millions d’euros.
Dans ces cinq régimes spéciaux, l’âge légal de départ à la retraite est fréquemment plus bas que 62 ans (cf. infra) : la durée de versement de la pension y est donc plus longue.
À compter du 1er septembre 2023, les assurés recrutés dans les entreprises ou organismes concernés seront affiliés à la branche vieillesse du régime général, ce qui d’ailleurs fluidifiera le marché du travail et ouvrira aux intéressés le bénéfice du compte personnel de prévention (C2P) pour l’exposition à certains risques.
En revanche, si les salariés et agents recrutés avant cette date demeureront rattachés aux régimes en question, ils se verront appliquer le décalage de deux ans l’âge légal et l’accélération de l’allongement de la durée de cotisation. Cette extinction progressive des affiliations (clause dite du grand-père), qui a déjà été appliquée dans le passé (par exemple récemment pour le régime de la SNCF) évite des transitions complexes pour les assurés et l’administration.
EFFECTIFS ET CHARGES DES RÉGIMES SPÉCIAUX EN 2021
(en nombre, en milliards d’euros et en années)
|
|
IEG |
CRPCEN |
RATP |
Banque de F. |
CESE |
|
Stock de cotisants |
135 427 |
62 854 |
42 444 |
8 392 |
175 |
|
Flux de nouveaux affiliés |
4 607 |
7 606 |
1 033 |
120 |
n. c. |
|
Prestations vieillesse |
5,2 Md€ |
0,8 Md€ |
1,2 Md€ |
0,5 Md € |
|
|
Durée de versement Femmes (moy. : 23,9 ans) Hommes (moy. : 19,6 ans) |
30,1 ans 26,5 ans |
23,9 ans 20 ans |
29,7 ans 26,9 ans |
35 ans 25,9 ans |
n. c.
|
|
Âge légal |
55 à 62 ans |
60 à 62 ans |
52 à 62 ans |
55 à 62 ans |
62 ans |
Note : pour la Banque de France et pour la durée de versement, les chiffres datent de 2020.
Source : annexe 2 du PLFRSS ; pour l’âge légal – documentation des régimes concernés.
Le poème du jour …
J’ai l’esprit tout ennuyé
Pierre de RONSARD
J’ai l’esprit tout ennuyé
D’avoir trop étudié
Les Phénomènes d’Arate ;
Il est temps que je m’ébatte
Et que j’aille aux champs jouer.
Bons Dieux ! qui voudrait louer
Ceux qui, collés sus un livre,
N’ont jamais souci de vivre ?
Que nous sert l’étudier,
Sinon de nous ennuyer ?
Et soin dessus soin accroître
A nous, qui serons peut-être
Ou ce matin, ou ce soir
Victime de l’Orque noir ?
De l’Orque qui ne pardonne,
Tant il est fier, à personne.
Source : Poème du jour, recueils de poèmes, biographie et oeuvres complètes des grands poètes
Pierre de Ronsard (né en septembre 1524 au manoir de la Possonnière, près du village de Couture-sur-Loir en Vendômois et mort le 28 décembre 1585 au Prieuré de Saint-Cosme en Touraine), est un des poètes français les plus importants du XVIe siècle.
« Prince des poètes et poète des princes », Pierre de Ronsard, adepte de l’épicurisme, est une figure majeure de la littérature poétique de la Renaissance. Auteur d’une œuvre vaste qui, en plus de trente ans, a touché aussi bien la poésie engagée et « officielle » dans le contexte des guerres de religions avec les Hymnes et les Discours (1555-1564), que l’épopée avec La Franciade (1572) ou la poésie lyrique avec les recueils des Les Odes (1550-1552) et des Amours (Les Amours de Cassandre, 1552 ; Les Amours de Marie, 1555 ; Sonnets pour Hélène, 1578).
Pierre est le fils cadet de Louis de Ronsard (chevalier qui accompagna les enfants de François Ier lors de leur captivité en Espagne en qualité de maître d’hôtel) et de Jeanne de Chauldrier. Il a étudié au Collège de Navarre à Paris en 1533. Il semblerait qu’il n’ait pas apprécié la vie rude de l’école médiévale.
Il est page auprès du dauphin, François, puis de son frère Charles, duc d’Orléans. Quand Madeleine de France épousa le roi Jacques V d’Écosse, en 1537, Ronsard fut attaché au service du roi et passa trois années en Grande-Bretagne. En 1539, il retourna en France et entra à l’Écurie royale. Il est dans la compagnie du duc d’Orléans.
Cette fonction lui offrit l’occasion de voyager : il fut envoyé en Flandre puis de nouveau en Écosse. Bientôt une fonction plus importante lui fut offerte et il devint le secrétaire de la suite de Lazare de Baïf, le père de son futur collègue de Pléiade et compagnon à cette occasion, Antoine de Baïf. Il a été attaché de la même manière à la suite du cardinal du Bellay-Langey et sa querelle mythique avec François Rabelais date de cette époque.
Cette carrière diplomatique prometteuse fut cependant subitement interrompue, une otite chronique qu’aucun médecin ne put guérir le laissa à moitié sourd. Pierre de Ronsard décida alors de se consacrer à l’étude.
Il choisit le Collège de Coqueret dont le principal était Jean Dorat, aussi professeur de grec et helléniste convaincu (qui fera partie de la Pléiade) qu’il connaissait puisqu’il avait été le tuteur de Baïf. Antoine de Baïf accompagna Ronsard ; Joachim du Bellay, le second des sept, les rejoignit bientôt. Muretus (Marc-Lavoine), passionné de latin, qui jouera un rôle important sur la création de la tragédie française, y était aussi étudiant à la même époque.
La période d’étude de Ronsard dura sept années et demie et le premier manifeste de ce nouveau mouvement littéraire prônant l’application des principes de la Pléiade a été écrit par Du Bellay. Défense et illustration de la langue française parut en 1549 : la Pléiade (ou Brigade, comme elle s’appelait à ses débuts) était alors lancée. Elle comprenait sept écrivains : Ronsard, Du Bellay, Baïf, Rémy Belleau, Pontus de Tyard, Jodelle et Jean Dorat. Un peu plus tard, Ronsard publia ses premières œuvres en 1550 dans ses quatre premiers recueils Odes.
En 1552, le cinquième livre des Odes fut publié en même temps que Les Amours de Cassandre. Ces recueils déclenchèrent une véritable polémique dans le monde littéraire. Une histoire illustre les rivalités et critiques qui existaient alors : on dit que Mellin de Saint-Gelais, chef de file de l’École marotique, lisait des poèmes de Ronsard de façon burlesque devant le roi afin de le dévaloriser. Cependant, Marguerite de France, la sœur du roi (plus tard duchesse de Savoie), prit à un moment le recueil des mains de Mellin et se mit à le lire, rendant aux poèmes toute leur splendeur : à la fin de la lecture, la salle était sous le charme et applaudit chaleureusement. Ronsard était accepté comme poète. Les deux poètes se réconcilièrent, comme l’indique le sonnet de M. de S. G. En faveur de P. de Ronsard.
Sa gloire fut subite et hors mesure. Sa popularité ne faillit jamais. En 1555-1556, il publia ses Hymnes. Il termina ses Amours en 1556 puis il donna une édition collective de ses œuvres, selon la légende à la demande de Marie Stuart, épouse du roi François II en 1560. En 1565, ce sont Élégies, mascarades et bergeries qui parurent en même temps que son intéressant Abrégé de l’art poétique français.
En 1563, poète engagé, il publie une Remontrance au peuple de France, puis une Réponse aux injures et calomnies de je ne sais quels prédicants et ministres de Genève, qui l’avaient attaqué pour sa défense du catholicisme.
L’Académie des Jeux floraux de Toulouse le récompense, en 1580, pour une pièce dans laquelle il chantait son aïeul Banul Mãrãcine, accouru des bords du Danube pour porter secours à « France, mère des arts, des armes et des lois. » Le peuple de Toulouse, estimant l’églantine, prix des Jeux floraux, trop modeste pour honorer « le poète français », lui envoya une Minerve d’argent massif de grand prix. Ronsard remercia le cardinal de Chastillon, archevêque de Toulouse, qui l’avait toujours admiré, en lui adressant l’« Hymme de l’Hercule chrestien ».
Le changement rapide de souverains n’altéra pas les traitements auxquels a droit Ronsard. Après Henri et François, c’est Charles IX qui tomba sous son charme. Il lui mit même des pièces à disposition dans le palais. Ce parrainage royal a eu quelques effets négatifs et l’œuvre demandée par Charles IX, La Franciade, n’égale pas le reste de l’œuvre de Ronsard, le choix fait par le roi (le décasyllabe plutôt que l’alexandrin) étant regrettable.
La mort de Charles IX ne sembla pas avoir changé les faveurs auxquelles il avait droit à la cour royale. Mais Ronsard, ses infirmités augmentant, choisit de passer ses dernières années loin de la cour, alternant ses séjours dans une maison lui appartenant à Vendôme, dans une abbaye à Croix-Val non loin de là ou encore à Paris où il était l’invité de Jean Galland, intellectuel du Collège de Boncourt. Il avait peut-être aussi une maison en propre au Faubourg Saint-Marcel. Il voyagea en Andalousie pendant trois mois, à Cordoue, où il trouva l’inspiration pour son poème Ode a l’Antiquité.
Ses dernières années furent marquées par la perte de nombreux de ses amis et son état de santé s’aggrava. Des souverains étrangers, dont la reine Élisabeth Ire d’Angleterre, lui envoyaient des présents. Malgré la maladie, ses créations littéraires restèrent toujours d’aussi bonne qualité et quelques-uns de ses derniers écrits sont parmi les meilleurs. Ronsard ne fit pas l’unanimité et on trouve des poèmes contre Ronsard dans la collection de manuscrits rassemblés par François Rasse des Nœux.
Ronsard meurt dans la nuit du 27 au 28 décembre 1585 au prieuré de Saint-Cosme, dont il était le prieur, et y est enseveli dans la crypte de l’église, aujourd’hui en ruine. Ronsard était également titulaire de Croix-Val en Vaudomois (paroisse de Ternay) et de Bellozane dans le diocèse de Rouen. Deux mois plus tard, il reçoit un hommage officiel au collège de Boncourt où ses funérailles solennelles sont célébrées à Paris le 25 février 1586, date anniversaire de la bataille de Pavie. Toute la cour s’y presse, à telle enseigne que plusieurs dignitaires devront renoncer à y assister, et l’oraison est prononcée par son ami Jacques Du Perron et un Requiem de Jacques Mauduit composé pour l’occasion est exécuté par l’orchestre particulier du roi.
Portrait de l’écrivain et homme politique Charles Maurras (1868-1952), fondateur de la revue « L’Action française ». AFP PHOTO
Pour le plus grand malheur de la France, nous dit l’auteur, ces fruits ont souvent été des fruits pourris.
Continuateur et d’une certaine manière amplificateur des idéaux de la Révolution, il en a recouvert la France, semant partout le désordre social, l’anarchie dans les ordres et la perturbation dans les familles.
Le Code Civil, génial par certains aspects, est une catastrophe par d’autres: notamment en ce qu’il inscrit dans le marbre de la loi le principe même de l’éclatement de la famille (à la mort du patriarche, au lieu que son domaine soit transmis à son aîné de manière à en perpétuer l’existence, les lois Napoléon prévoient que tous ses enfants en héritent, ce qui provoquera le dispersement du domaine, sa mise en vente pour assurer le partage équitable ; de cette manière, les bastions familiaux ont éclaté, et avec eux la pérennité d’un certain ordre social hérité des siècles).
Sur le chapitre de la politique étrangère, Charles Maurras est formel: le bilan de Napoléon est une catastrophe qui a semé les graines des futures grandes guerres, 1870 et 1914.
Coupable de n’avoir pas coupé l’arbre prussien dans ses racines lorsqu’il en avait encore le pouvoir — ce qu’il fallait faire pour la sécurité future de la France, insiste Maurras —, il a par conséquent laissé se bâtir un empire hostile qui devait, plus tard, devenir assez gros pour nuire à la France.
Source : Ce que Charles Maurras reprochait à Napoléon – Causeur
EDITION
https://www.livreshebdo.fr/article/steinbeck-en-pleiade-sortie-dusine
Quatre romans de Steinbeck sortent ce jeudi dans la prestigieuse collection de Gallimard, dont le processus de fabrication n’a pas changé depuis 1931. De la papeterie à la reliure, visite des ateliers de la Pléiade.
Plus de 60 ans après son prix Nobel, John Steinbeck fait son entrée à la Pléiade, la fameuse bibliothèque de Gallimard dont le catalogue forme un Panthéon des lettres. Le volume consacré à John Steinbeck réunira En un combat douteux (1936), Des souris et des hommes (1937), Les raisins de la colère (1939) et A l’Est d’Eden (1952). Comme tous les autres ouvrages de la Pléiade, sa fabrication a suivi un protocole méticuleux.
Depuis la création de la collection en 1931, intégrée aux éditions Gallimard en 1933, la maquette n’a pas bougé. Format poche, papier bible opacifié, caractères Garamond, couverture cuir, dos doré à l’or fin, étui blanc : les ouvrages de la Pléiade sont immédiatement reconnaissables. C’est le résultat d’une « exigence » dans tout le parcours de fabrication, comme le souligne Pascal Lenoir, le directeur de production de Gallimard. « Le lecteur de la Pléiade, dit-il, s’attend à ce que son volume acheté en librairie soit parfait ».
La fabrication d’un volume est un processus industriel et artisanal de haute précision qui ne nécessite pas moins de trois usines : une fabrique de papier ultrafin, une imprimerie et un atelier de reliure et décoration.
La création physique de l’ouvrage commence donc à la Papeterie du Léman, près du lac du même nom, à Publier (Haute-Savoie).
Quand elle a commencé à travailler pour la Pléiade, cette papeterie appartenait au groupe Bolloré. Et même si son propriétaire l’a revendue en 2009 et s’est diversifié au point de devenir rival de Gallimard dans l’édition, son nom reste imprimé en fin de volume : le précieux papier est toujours signé Bolloré Thin Papers.
Il sort de la machine à papier n°4. « Elle fait à peu près 80 mètres de long, du début à la fin, sur trois étages, puisqu’il y a énormément d’étapes pour fabriquer une feuille de papier », explique Ivan Fourmond, le responsable de production. Elle crache de grosses bobines, parfaitement lisses et uniformes. Cette machine travaille à la commande quelques fois par an seulement. Pour le volume de John Steinbeck, c’était début décembre: lui aussi bénéficie du papier bible 36 chamois. Soit un poids de 36 grammes par mètre carré, coloré d’une nuance de jaune proche du beige.
Les bobines prennent ensuite la direction du site de Normandie Roto Impression, en périphérie d’Alençon, à 800 km de là. Le seul qui ait la confiance des éditions Gallimard.
Là, « le papier vierge rentre dans le groupe d’impression. On imprime recto-verso et en deux cahiers de 48 pages. C’est-à-dire qu’on imprime 96 pages en une rotation du groupe d’impression », détaille Christophe Pillon,directeur général du site. Le résultat est ensuite vérifié par l’œil humain. L’alignement des blocs de texte recto et verso doit être impeccable. Posés à plat, les cahiers partent alors pour la dernière étape, aux Ateliers Babouot, de Lagny-sur-Marne (77).
Ils vont commencer par y reposer dans un entrepôt de 3.700 m2, qui compte en réserve quelque 300 auteurs différents dont les œuvres sont prêtes à être reliées de nouveau. La Pléiade est en effet un cas quasi unique de réimpressions s’étalant sur des décennies.
Installé près des bords de Marne depuis un demi-siècle, les Ateliers sont volontairement humides, une hygrométrie plutôt élevée permettant au papier bible de conserver plus de souplesse et de régularité. Les tâches qui se succèdent ensuite pour le transformer en livre demandent le même soin. « Nos machines doivent se plier à l’exigence de Gallimard » et « l’opérateur doit s’adapter aux machines de différentes époques », souligne Marie-Amandine Erika, technicienne de fabrication.
Défauts d’impression ou de pliure sont d’abord traqués. Puis les cahiers sont assemblés avec du fil de couture en coton, collés ensemble, dotés d’une page de garde, maintenus dans une « mousseline » et massicotés. Il faut ensuite leur adjoindre la fameuse couverture cartonnée habillée de cuir, des peaux de moutons de Nouvelle-Zélande tannées et teintes en France. A chaque siècle sa couleur : havane pour le XXe, donc pour Steinbeck. Les dos, soumis à une courbure élégante par une machine, sont décorés à l’or 23 carats, avec des fers qui appliquent les rayures horizontales caractéristiques de la collection. Pour 260.000 exemplaires par an, Gallimard consomme quelque 45 kg du précieux métal.
Contrôlé et recontrôlé à chaque étape, chaque volume est achevé, à la main, quand il reçoit sa jaquette plastique transparente en rhodoïd et son étui. Le travail des Ateliers aura duré trois semaines. Voilà Steinbeck en 1664 pages enfin prêt à rejoindre le diffuseur puis les rayons des libraires. Au début de l’introduction du volume, page IX, le lecteur découvrira ses mots de 1939 : « Je n’ai jamais voulu être un écrivain populaire ». Il est vrai qu’en Pléiade Steinbeck aura eu un traitement de luxe fort peu prolétarien.
Au premier semestre 2023, quatre auteurs font leur entrée dans ce catalogue de plus de 650 ouvrages : Colette en janvier, Steinbeck en mars puis Yves Bonnefoy, sept ans après sa mort, et enfin Louis-Ferdinand Céline avec une édition augmentée des inédits récemment publiés.
« Nous vendons 230 000 à 240 000 exemplaires par an », dont 7% à l’export, indiquait en 2021 à Livres Hebdo Jean-Charles Grunstein, directeur commercial de la maison. Cela représente 10% du chiffre d’affaires net de Gallimard, qui soigne l’image de marque de cette collection perçue comme un objet de luxe. « Plus la bibliothèque est visible, mieux elle se vend », assurait-il. L’éditeur distribue auprès des libraires des chaînettes pour permettre la consultation des exemplaires et organise des rencontres en librairies.
La meilleure vente du fonds de la Pléiade reste Antoine de Saint-Exupéry, suivi de Proust, Camus, Verlaine et Rimbaud. Du Théâtre espagnol du XVIIe siècle (4 400 exemplaires vendus) aux Misérables de Victor Hugo (plus de 130 000 exemplaires écoulés), la Bibliothèque, dont la valeur totale dépasse les 15 000€, se veut universelle.
Avec Isabel Contreras
[EN VIDÉO] Le fantastique pouvoir des cellules souches La jeunesse éternelle semble être une quête aussi ancienne que l’humanité. Il se pourrait que…
Régénérer les cellules ciliées cochléaires de l’oreille pour inverser la progression de la perte d’audition, est-ce vraiment possible ? C’est en tout cas la piste des chercheurs du Del Monte Institute for Neuroscience (États-Unis), après identification des mécanismes qui pourraient favoriser ce type de régénération chez les mammifères. Les résultats de l’étude sont publiés dans Frontiers in Cellular Neuroscience.
De précédents travaux avaient montré que l’activation de la voie du gène de croissance ERBB2 déclenchait des événements cellulaires en cascade, aboutissant à la multiplication des cellules de soutien de la cochlée et à l’activation de cellules souches voisines qui deviennent de nouvelles cellules ciliées. « Lorsque nous avons vérifié ce processus chez des souris adultes, nous avons pu montrer que la présence du gène ERBB2 entraînait notamment l’expression de la protéine SPP1, laquelle est nécessaire à l’activation du récepteur CD44 [présent dans les cellules de soutien de la cochlée] et à la croissance de nouvelles cellules ciliées », a expliqué Dorota Piekna-Przybylska, docteure en sciences et coauteure de l’étude.
CHEZ LES OISEAUX ET LES POISSONS, LES CELLULES CILIÉES PERDUES SONT RÉGÉNÉRÉES PAR LA PROLIFÉRATION DE CELLULES DE SOUTIEN ET LA DIFFÉRENCIATION DE NOUVELLES CELLULES CILIÉES, CE QUI PERMET DE RESTAURER L’AUDITION ! © MZPHOTO11, ADOBE STOCK
De base, la perte auditive est irréversible et progressive chez les mammifères, car les cellules ciliées ne peuvent pas se régénérer si elles sont endommagées ou perdues. Les personnes les plus touchées par ce type de dommage auditif sont celles exposées de façon répétée à des bruits forts, comme le personnel militaire, les ouvriers du bâtiment et les musiciens.
Les chercheurs prévoient maintenant d’approfondir l’étude de ce phénomène d’un point de vue mécanistique afin de déterminer s’il peut améliorer la fonction auditive après un dommage.
PAR CLAIRE MANIÈRE
LE 3 MARS 2023
Dorota Piekna-Przybylska1, 
Daxiang Na1, 
Jingyuan Zhang2†, 
Cameron Baker3, 
John M. Ashton3 et 
Patricia M. Blanc1*La perte auditive causée par la mort de cellules capillaires cochléaires ( HCs ) pourrait être restaurée par régénération à partir de cellules de soutien ( SCs ) via la dédifférenciation et la prolifération, comme observé chez les oiseaux. Dans un rapport précédent, l’activation d’ERBB2 dans un sous-ensemble de SC cochléaires a favorisé la régulation négative généralisée du SOX2 dans les cellules voisines, la prolifération et la différenciation des cellules de type HC. Ici, nous analysons les transcriptomes unicellulaires à partir de SC cochléaires de souris néonatales avec ERBB2 activé, dans le but d’identifier les effecteurs potentiels sécrétés. Induction ERBB2 in vivo généré une nouvelle population de cellules avec de novoexpression d’un réseau génétique. Appelés petites glycoprotéines n-liées à l’intégrine et à la liaison à l’intégrine ( SIBLING ), ces ligands et leurs régulateurs peuvent modifier la signalisation NOTCH et favoriser la survie, la prolifération et la différenciation des cellules dans d’autres systèmes. Nous avons validé l’expression d’ARNm des membres du réseau, puis étendu notre analyse aux étapes plus anciennes. La signalisation ERBB2 chez les jeunes SC adultes a également favorisé l’expression protéique des membres du réseau génétique. De plus, nous avons trouvé des agrégats cellulaires cochléaires proliférants dans l’organe de Corti. Nos résultats suggèrent que l’activation ectopique de la signalisation ERBB2 dans les SC cochléaires peut modifier le microenvironnement, favorisant la prolifération et les réarrangements cellulaires. Ensemble, ces résultats suggèrent un nouveau mécanisme pour induire une activité semblable à une cellule souche dans la cochlée de mammifère adulte.
Les cellules ciliées auditives perdues ( HC ) chez les mammifères adultes ne peuvent pas être régénérées, entraînant une perte auditive permanente. À l’inverse, les HC perdus chez les oiseaux sont régénérés par la prolifération des cellules de soutien ( SCs ) et la nouvelle différenciation HC (Corwin et Cotanche, 1988; Ryals and Rubel, 1988), conduisant à la restauration de l’audition (Ryals et al., 2013). Une capacité de régénération limitée dans l’organe de Corti est également observée chez les mammifères nouveau-nés et est associée à un pool de cellules progénitrices dans l’épithélium sensoriel cochléaire (Atkinson et al., 2015; Zhang et al., 2020). Il s’agit notamment d’un sous-ensemble de SC à proximité des HC, tels que les cellules frontalières internes ( IBC ), les cellules du pilier interne ( IPC ), les cellules du déitre de troisième rangée ( DC ), et crête épithéliale supérieure latérale ( LGER ) (Chai et al., 2011; Shi et al., 2012; Kubota et al., 2021). Des études axées sur les voies de signalisation chez la souris qui entraînent la régénération de HC avant le début de l’audition suggèrent que HC peut se régénérer par division mitotique suivie d’une différenciation, via Activation du signal WNT (Chai et al., 2012; Shi et al., 2012, 2014). Alternativement, les HC peuvent se régénérer à partir des cellules progénitrices par voie directe trans-différenciation, en bloquant la signalisation NOTCH (Yamamoto et al., 2006; Korrapati et al., 2013; Mizutari et al., 2013; Bramhall et al., 2014). À mesure que la maturation progresse, les cellules cochléaires se limitent des deux mécanismes de régénération (Brown and Groves, 2020). Ces résultats ont été interprétés comme signifiant que même une capacité de régénération limitée est perdue à cause de la cochlée de mammifères adultes. Notamment, les progéniteurs des cellules de type HC peuvent provenir de cellules proliférantes dans les cultures sphériques du tissu utriculaire humain adulte, mais pas de tissus cochléaires adultes (Senn et al., 2020). Néanmoins, ces résultats n’excluent pas la possibilité que des progéniteurs cochléaires de mammifères adultes au repos existent (Hoa et al., 2020), mais nécessitent un microenvironnement différent pour manifester leur potentiel.
La restauration auditive chez les oiseaux a lieu quel que soit l’âge. Les premières études ont montré que la signalisation par la phosphoinositide 3-kinase ( Pi3K ) et la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique ( EGFR ) sont nécessaires pour la prolifération de l’oreille interne SC chez les souris de poulet et de néonatale (Witte et al., 2001; White et al., 2012). D’autres études sur la régénération aviaire ont impliqué l’activation du VEGF, qui signale également via PI3K (Matsunaga et al., 2020; Wan et al., 2020). Dans la famille EGFR, il existe quatre récepteurs tyrosine kinases étroitement liés: ERBB1, ERBB2, ERBB3 et ERBB4. Ceux-ci forment des homo ou des hétérodimers les uns avec les autres lors de la liaison du ligand et induisant des voies moléculaires SC prolifération, migration et survie. Nous avons précédemment montré que la signalisation médiée par ERBB2, qui est le partenaire d’hétérodimérisation préféré des trois autres membres de la famille EGFR, stimule la prolifération des SC dans les cultures explantes et la formation surnuméraire de type HC in vivo dans la cochlée de souris néonatale (Zhang et al., 2018). Notamment, dans ces études, le traçage de la lignée a révélé que les cellules exprimant une forme mutante ( CA ) constitutive d’ERBB2 ont induit ces activités dans les cellules voisines, suggérant la présence d’une cascade de signal amplificateur qui recrute des tissus adjacents. Conformément à cette interprétation, la protéine SOX2 a été largement régulée à la baisse dans le virage apical abritant des cellules CA-ERBB2 clairsemées + (Zhang et al., 2018).
Identifier les voies de signalisation médiées par ERBB2 associées aux changements de SC qui peuvent faciliter la régénération de HC, nous avons effectué un séquençage d’ARN monocellulaire ( scRNA-seq ) sur des SC néonatals triés avec et sans CA-ERBB2. Nous avons effectué une analyse génétique spécifique au cluster pour identifier les gènes exprimés différentiellement ( DEGs ) dans différentes populations cellulaires. Nos objectifs étaient d’identifier des grappes de cellules CA-ERBB2 qui sont transcriptionnellement distinctes, attribuer des clusters et des DEG aux sous-types SC et identifier les voies de signalisation secondaires candidates qui pourraient agir en aval de la signalisation ERBB2 pour promouvoir les changements locaux. Nous avons en outre cherché à confirmer si certains médiateurs en aval étaient également exprimés dans la cochlée de jeunes souris adultes après dommages et activation CA-ERBB2, et si oui, où ils étaient localisés.
Toutes les expériences utilisant des animaux ont été approuvées à l’avance par le Comité universitaire de recherche animale ( UCAR ) à l’Université de Rochester, numéro de protocole 2010-011, PI Patricia White, et par le Bureau d’examen des soins et utilisations des animaux ( ACURO ) du ministère de la Défense.
Les souches de souris suivantes ont été utilisées. Fgfr3-iCre (Cox et al., 2012) était un cadeau aimable du Dr. Jian Zuo. TetON-CA-ErbB2 (Xie et al., 1999) et CBA / CaJ, ont été achetés aux Laboratoires Jackson. ROSA-floxed-rtTA / GFP (Belteki et al., 2005) était un cadeau aimable du Dr. Lin Gan. Les souris TetON-CA-ErbB2 hébergent un ErbB2 transgène codant pour une protéine CA ERBB2 ( CA-ERBB2 ), qui ne nécessite pas de liaison ligand ou d’hétérodimérisation avec d’autres partenaires ERBB pour la signalisation active. Les souris Fgfr3-iCre et TetON-CA-ERBB2 étaient des croisements pour générer des souris transgéniques hétérozygotes doubles qui ont ensuite été utilisées comme éleveurs. Dans une deuxième reproduction, des hétérozygotes doubles ont été croisés avec des souris homozygotes ROSA-floxed-rtTA / GFP.
Pour les expériences scRNA-seq et la validation des données par RT-qPCR, les chiots générés ont été génotypés à P0 pour identifier les souris triple transgéniques qui hébergent Fgfr3-iCre, ROSA-floxed-rtTA / Gfp, et TetON-CA-ErbB2 ( nommé ici CA-ERBB2 ). Les chiots n’étaient pas génotypés pour identifier le sexe. Les oligonucléotides utilisés dans le génotypage sont fournis dans Tableau supplémentaire 2. Littermates avec les deux Fgfr3-iCre et ROSA-floxed-rtTA / Gfp ont été utilisés comme contrôles.
Pour la validation des données scRNA-seq chez les jeunes adultes exposés au bruit, les souris mâles et femelles ont été utilisées de manière égale. Des souris abritant le Fgfr3-iCre et CA-Erbb2 les transgènes ont été rétrocroisés à CBA / CaJ pendant au moins quatre générations, tandis que la ligne ROSA-rtTA-GFP est congénique sur C57BL6 / J. Ainsi, les souris expérimentales sont des souris hybrides CBA / C57, dont les caractéristiques de dommages sonores sont similaires à une réponse pure CBA / CaJ (Milon et al., 2018). Les souris de trois semaines ont été génotypées et sevrées. Des injections de tamoxifène ( 75 mg / kg ) ont été effectuées à P21, P22 et P23. À P28, leur audition a été testée par une réponse auditive du tronc cérébral ( ABR ) et des émissions acoustiques des produits de distorsion ( DPOAE ) (Zhang et al., 2021). Les souris ont ensuite été divisées en conditions d’exposition et de contrôle DOX. Les souris ont connu une exposition au bruit de 110 dB de 8 – 16 kHz de bruit de bande d’octave pendant 2 h, comme décrit précédemment (Zhang et al., 2021). Le lendemain ( 1 DPN ), des souris ont reçu des tests auditifs pour confirmer une perte auditive sévère induite par le bruit évidente par décalage de seuil pendant au moins 25 dB sur cinq fréquences ( 8, 12, 16, 24 et 32 kHz ). Deux jours plus tard ( 3 DPN ), le groupe DOX a reçu une injection de DOX ( 100 mg / kg ), suivie 30 min plus tard d’une injection de furosémide ( 400 mg / kg ) (Walters et Zuo, 2015). Le groupe témoin a reçu une injection saline, suivie de furosémide. Deux jours après ces injections ( 5 DPN ), les souris ont été euthanasiées et leurs cochlées fixées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4. Une deuxième cohorte de souris a été traitée de manière identique, sauf qu’elles ont également reçu 2 injections de 10 mg / kg 5-éthyl-2′-désoxyuridine ( EdU ) du kit d’imagerie Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogène, Carlsbad, CA, USA ), le lendemain de l’injection de DOX ( 4 DPN ) espacés de 8 h. Ces souris ont été euthanasiées sur 7 DPN et leurs cochléaires ont été fixées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4.
L’activité iCRE a été induite par des injections de tamoxifène ( 75 mg / kg ) au P0 / P1 pour étiqueter les SC avec GFP et rtTA. Des injections de doxycycline ( 100 mg / kg ) ont été effectuées à P2 pour entraîner l’expression CA-ERBB2 dans les SC GFP +. La cochlée des chiots P3 a été collectée et incubée avec 1 ml d’Accutase®solution ( Technologies cellulaires innovantes ) pendant 15 min à 37 ° C. Pour assurer une digestion reproductible, 2 – 4 cochlée ont été traités par tube. La solution Accutase a été retirée et la cochlée était des lavages doux dans du tampon HBSS libre de Ca2 +, Mg2 +. Les organes de chaque tube ont été dissociés par trituration pendant 2 – 3 min. Les cellules ont ensuite été filtrées avec une crépine cellulaire de 40 μm ( BD Biosciences ) et maintenues sur la glace jusqu’au tri. Pour l’exclusion des cellules mortes et des débris des échantillons pendant le tri, une suspension monocellulaire a été colorée avec du DAPI. Le tri a été effectué à 4 ° C dans un trieur de cellules FACSAria II ( BD Biosciences ) à l’aide d’une buse de 130 μm. La discrimination par dispersion a été utilisée pour éliminer les doublets et les échantillons ont été sélectionnés négativement avec le DAPI pour éliminer les cellules mortes et les débris. Pour scRNA-seq, des cellules GFP + simples ont été capturées dans une plaque à 96 puits avec 11.Tampon de lyse de 5 μl et inhibiteur de RNase sans le CDS IIA Oligo ( Takara Bio, Mountain View, CA, USA ), et stocké à − 80 ° C jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour la construction de bibliothèques d’ADNc. En moyenne, six chiots par génotype ont été traités pour trier des cellules GFP + simples en une seule plaque à 96 puits. Pour la validation des données par RT-qPCR, les cellules GFP + ont été capturées dans un seul tube avec un tampon de lyse de 100 μl contenant de la protéinase K et de la DNase ( Biodrome ). Les cellules triées ont ensuite été incubées pendant 10 min. à température ambiante, suivie de 5 min. à 37 ° C, et 5 min. à 75 ° C. Les échantillons ont été stockés à − 80 ° C jusqu’à l’analyse RT-qPCR.Pour la validation des données par RT-qPCR, les cellules GFP + ont été capturées dans un seul tube avec un tampon de lyse de 100 μl contenant de la protéinase K et de la DNase ( Biodrome ). Les cellules triées ont ensuite été incubées pendant 10 min. à température ambiante, suivie de 5 min. à 37 ° C, et 5 min. à 75 ° C. Les échantillons ont été stockés à − 80 ° C jusqu’à l’analyse RT-qPCR.Pour la validation des données par RT-qPCR, les cellules GFP + ont été capturées dans un seul tube avec un tampon de lyse de 100 μl contenant de la protéinase K et de la DNase ( Biodrome ). Les cellules triées ont ensuite été incubées pendant 10 min. à température ambiante, suivie de 5 min. à 37 ° C, et 5 min. à 75 ° C. Les échantillons ont été stockés à − 80 ° C jusqu’à l’analyse RT-qPCR.
Les bibliothèques RNA-seq monocellulaires ont été construites selon le protocole SMART-Seq Single PLUS ( Takara Bio, Mountain View, CA, USA ). Des plaques congelées ont été décongelées sur de la glace. Ensuite, l’ADNc a été généré avec l’ajout des réactifs 3 ′ SMART-Seq CDS Primer II A et SMARTScribe II RT. l’ADNc a été amplifié via20 cycles de PCR, purifiés et évalués pour la quantité et la qualité par le test d’ADNdQubit ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ) et Fragment Analyzer ( Agilent, Santa Clara, CA, Analyse USA ), respectivement. Pour chaque puits, l’ADNc amplifié de 1 ng a été fragmenté et préparé pour la construction de la bibliothèque avec l’ajout d’adaptateurs de boucle de tige. L’amplification et l’indexation finales de la bibliothèque ont été effectuées sur 16 cycles d’amplification PCR. Après la purification des billes, les profils de bibliothèque individuels ont été évalués par Fragment Analyzer et quantifiés par le test dsDNA de Qubit. Les bibliothèques ont été diluées, regroupées en quantités équimolaires et séquencées sur une cellule de flux NovaSeq S1 ( Illumina, San Diego, CA, USA ) pour générer en moyenne 10 millions de lectures par cellule.
Les lectures brutes générées à partir des plinthes Illumina ont été démultiplexées à l’aide de la version 2.19.1 de bcl2fastq. Le filtrage de qualité et la suppression de l’adaptateur sont effectués à l’aide de la version FastP 0.20.1 avec les paramètres suivants: “ – length_quality 13 – cut_front_tail_tail_1size Les lectures traitées / nettoyées ont ensuite été mappées au Mus musculusgénome de référence ( GRCm38 + Gencode-M25 Annotation ) en utilisant STAR_2.7.6a avec les paramètres suivants: “ — twopass Mode Basic – runMode aligneReads – outSAMtype BAM TriedByCoordinate — La quantification de la lecture au niveau du gène a été dérivée à l’aide du package subread-2.0.1 ( featureCounts ) avec un fichier d’annotation GTF ( Gencode M25 ) et les paramètres suivants: “ -s 2 -t exon -g gene_name. ” Les données générées par le séquençage ont été utilisées pour créer un objet Seurat à l’aide du package Seurat dans R ( v4.0.5 et v4.1.2 ). Les mesures de contrôle de la qualité ont été effectuées à l’aide des protocoles standard Seurat ( v4.0.4 et v4.1.0 ) et comprenaient l’identification de gènes uniques ( “ caractéristiques ” ) par cellule, le nombre total de molécules détectées ( “, et le pourcentage de contamination du génome mitochondrial.Les données ont été normalisées. Les clusters ont été identifiés avec la méthode Louvain, en utilisant PCA et UMAP pour réduire la dimensionnalité et tracer les cellules. Le clustering a été effectué en utilisant une réduction de dimensionnalité de 1:30 et deux résolutions distinctes, 0.2 et 0.6, dans la construction du graphique du plus proche voisin et la génération UMAP. En plus d’effectuer le filtrage et le regroupement des échantillons, Seurat a manipulé l’expression différentielle pour déterminer les gènes régulés à la hausse au sein des grappes et entre les groupes de condition. enrichR ( v3.0 ) a été utilisé pour effectuer un enrichissement de l’ensemble génétique sur les DEG (dans la construction du graphique du plus proche voisin et la génération UMAP. En plus d’effectuer le filtrage et le regroupement des échantillons, Seurat a manipulé l’expression différentielle pour déterminer les gènes régulés à la hausse au sein des grappes et entre les groupes de condition. enrichR ( v3.0 ) a été utilisé pour effectuer un enrichissement de l’ensemble génétique sur les DEG (dans la construction du graphique du plus proche voisin et la génération UMAP. En plus d’effectuer le filtrage et le regroupement des échantillons, Seurat a manipulé l’expression différentielle pour déterminer les gènes régulés à la hausse au sein des grappes et entre les groupes de condition. enrichR ( v3.0 ) a été utilisé pour effectuer un enrichissement de l’ensemble génétique sur les DEG (Xie et al., 2021). Un rapport final a été rendu à l’aide de RStudio et rmarkdown ( v2.10 ). L’identité des gènes a été analysée dans la ressource Gène Ontologie ( GO )1 (Xie et al., 2021). L’analyse du processus biologique GO a été réalisée pour les gènes exprimés identifiés dans chaque cluster. Puisqu’il y avait de nombreux gènes exprimés pour certains des clusters, nous avons limité le nombre de marqueurs provenant de clusters spécifiques basés sur le changement de log-fold. Le seuil de changement de log-fold pour le cluster S7 était de 4, pour le cluster S0 était de 4 et pour le cluster S5 était de 6. Le seuil de changement de log-fold pour les clusters restants est resté à 2. Les modules du réseau d’interaction protéique ont été visualisés à l’aide de l’analyse en ligne du réseau STRING2 (Szklarczyk et al., 2021).
Les lysats cellulaires préparés après le tri des cellules GFP + en tube unique ont été utilisés dans l’analyse RT-qPCR à l’aide de réactifs RT-qPCR en deux étapes SingleShot ( Biodrome-Rad ) conformément aux instructions de fabrication. Chaque réaction qPCR a été effectuée sur des cellules lysées correspondant à 10 cellules. Trois répétitions techniques ont été utilisées pour chaque gène analysé. Des puits avec des amorces mais sans échantillon d’ADNc ont été utilisés pour les témoins négatifs, tandis que les lysats cellulaires non traités avec la transcriptase inverse ont été utilisés comme contrôle de la contamination par l’ADN génomique. Les réactions qPCR ont été effectuées à l’aide du vélo thermique CFX Bio-Rad et le seuil de cycles ( Ct ) a été calculé avec le logiciel Bio-Rad CFX Manager. La méthode ΔΔCt a été utilisée pour calculer l’expression relative du gène. Eef1a1 et Tubb4a ont été précédemment testés et indiqués comme des gènes d’entretien ménager exprimant stables adéquats pour la normalisation (Park et al., 2016), et ont été utilisés ici comme gènes de référence pour calculer les différences d’expression des gènes entre les cellules Control et CA-ERBB2. Les valeurs Ct des répétitions techniques ont été moyennées et l’expression du gène dans l’échantillon CA-ERBB2 et l’échantillon de contrôle a été normalisée au niveau d’expression du gène de référence ( “ REF ” ) dans le même échantillon à déterminer ΔCt [ Ct ( gène )— Ct ( REF )]. Pour chaque gène, l’analyse de l’expression relative du gène a été effectuée à partir d’au moins trois échantillons biologiques ( trois triages FACS indépendants ). Le ΔCt pour chaque répétition biologique a été exponentiellement transformé en expression ΔCt ( 2– ΔCt) avant la moyenne et la détermination de l’écart type ( SD ). La moyenne a ensuite été normalisée à l’expression du gène dans l’échantillon de contrôle pour trouver l’expression ΔΔCt dans l’échantillon CA-ERBB2. Les oligonucléotides utilisés dans la RT-qPCR sont fournis dans Tableau supplémentaire 2.
Les cochlées fixes ont été décalcifiées dans 100 mM EDTA dans une solution saline à 4 ° C pendant 3 jours. Pour le cryoséctionnement, les tissus ont été immergés dans 30% de saccharose dans du PBS pendant la nuit, incorporés dans des PTOM, congelés dans de l’azote liquide et cryoséctionnés à 20 microns. Les sections ont été montées sur du verre coulissant et maintenues à − 30 ° C jusqu’à utilisation. L’immunostat des sections cochléaires de cryostat a été effectué pour examiner l’expression de gènes sélectionnés. Les sections ont été perméabilisées et bloquées dans du PBS avec 0,5% de sérum d’âne Triton X-100 et 5% ( tampon TDB ) pendant 1 h à 4 ° C, suivi d’une incubation avec des anticorps primaires dans TDB à 4 ° C pendant la nuit. Les sections ont été rincées brièvement quatre fois dans du PBS, puis incubées avec des anticorps secondaires dans du TDB à 4 ° C pendant la nuit. Les sections ont été rincées brièvement 4 fois en PBS. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés: anti-GFP de poulet ( 1: 100; Abcam; AB_300798 ),souris anti-PVALB ( 1: 1 000, EMD Millipore; MAB1572 ), chèvre anti-OPN ( SPP1; 1: 100; Systèmes de R&D; AF808 ), chèvre anti-TIMP1 ( 1: 09, lapin anti-CD44 ( 1: 100; Abcam; AB157107 ), lapin anti-pERBB2 ( 1: 200; Santa Cruz; sc-12352 ), chèvre anti-SOX2 ( 1: 500; Santa Cruz; sc-1, lapin anti-MYO7 ( 1: 1 000; Proteus; 25-6790 ), lapin anti-activé CASP3 ( 1: 500; Systèmes de R&D, AF835 ) et lapin anti-TAK1 ( 1: 500; Thermo Fisher Scientific; 28. Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.Systèmes D; AF980 ), lapin anti-CD44 ( 1: 100; Abcam; AB157107 ), lapin anti-pERBB2 ( 1: 200; Santa Cruz; sc-12352 ), chèvre anti-SOX2 ( 1: 5000; sc-17320 ), lapin anti-MYO7 ( 1: 1 000; Proteus; 25-6790 ), lapin anti-activé CASP3 ( 1: 500; R&D Systems, AF835 ) et lapin anti-TAG1: 5; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.Systèmes D; AF980 ), lapin anti-CD44 ( 1: 100; Abcam; AB157107 ), lapin anti-pERBB2 ( 1: 200; Santa Cruz; sc-12352 ), chèvre anti-SOX2 ( 1: 5000; sc-17320 ), lapin anti-MYO7 ( 1: 1 000; Proteus; 25-6790 ), lapin anti-activé CASP3 ( 1: 500; R&D Systems, AF835 ) et lapin anti-TAG1: 5; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.et lapin anti-TAK1 ( 1: 500; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.et lapin anti-TAK1 ( 1: 500; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.
Pour effectuer une analyse scRNA-seq des SC exprimant ERBB2, nous avons utilisé le même modèle génétique de souris qui a révélé un effet indirect de l’activation d’ERBB2 sur l’expression SOX2 et la formation de cellules de type HC ectopique (Figure supplémentaire 1; Zhang et al., 2018). Ces souris abritent un inductible muté ErbB2 codage transgène CA-ERBB2. Afin de limiter l’activation de CA-ERBB2 aux SC, nous avons utilisé une ADN Cre recombinase inductible sous le contrôle du promoteur du gène SC Fgfr3 (Figure supplémentaire 2; Cox et al., 2012). Double souris hétérozygotes ( “ Tet-On ” CA-ErbB2, Fgfr3-iCre) a ensuite été élevé sur une ligne homozygote abritant un facteur de transcription TA “ floxed ”, avec un IRES-GFP à utiliser comme marqueur de lignée ( “ROSA-rtTA-Gfp” ). Les chiots résultants avec CA-ErbB2 et Fgfr3-iCre ( désigné ici comme “ CA-ERBB2 ” ) ont été utilisés pour analyser le transcriptome des SC avec signalisation ERBB2 induite; tandis que les chiots hébergeant Fgfr3-iCre ont été utilisés comme “ Contrôle. ” L’activation d’iCRE a été effectuée par deux injections de tamoxifène à P0 et P1, ce qui a entraîné l’expression de GFP pour étiqueter les SC (Figure supplémentaire 1). L’expression CA-ERBB2 a été induite à P2 par injection de doxycycline. Les organes de Corti ont été disséqués des chiots P3 et les GFP vivants + SC ont été purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence ( FACS ) en excluant les cellules qui avaient absorbé un colorant imperméable aux cellules (Figure supplémentaire 2). En moyenne, nous avons obtenu 55 ± 13 cellules GFP + par cochlée. Les bibliothèques d’ADNc d’ARN ont été préparées et séquencées à partir d’environ 300 GFP + cellules uniques par génotype collectées dans trois expériences FACS indépendantes avec 85% de cellules ayant moins de 20% d’expression de transcription mitochondriale (Figure supplémentaire 3).
Les mesures de contrôle de la qualité ont révélé un nombre similaire de transcriptions et de dénombrements d’IMU pour les deux génotypes (Figure 1A). Un tracé UMAP préliminaire de toutes les cellules a révélé un mélange de CA-ERBB2 et de cellules de contrôle ainsi que des preuves de leur différenciation séparée (Figure 1A, à droite ). Un regroupement impartial ( résolution de regroupement de 0,2 ) a ensuite été utilisé pour regrouper toutes les cellules GFP + avant l’évaluation des changements de transcriptome associés à l’expression CA-ERBB2. Sur la base du modèle d’expression génique, les cellules GFP + purifiées FACS peuvent être regroupées en au moins 5 grappes (Figures 1B, C). Deux grappes ont montré des différences significatives entre les échantillons de contrôle et CA-ERBB2 dans la distribution des cellules cochléaires: le cluster C4, composé principalement de cellules de contrôle, et le cluster C3 entièrement formé par des cellules CA-ERBB2. Des changements importants dans la distribution cellulaire ont également été observés au sein du cluster C2, où les cellules CA-ERBB2 se sont clairement séparées des cellules de contrôle. Il n’y avait aucune différence entre Control et CA-ERBB2 dans la distribution des cellules cochléaires dans les grappes C0 et C1. Ces résultats suggèrent une hétérogénéité dans les réponses des SC à l’activation intrinsèque d’ERBB2. Dans une minorité de cellules GFP +, l’activation ERBB2 a entraîné une réponse transcriptionnelle plus importante, qui différenciait les cellules activées de la population parentale.
Figure 1. Clustering impartial de Seurat des transcriptomes SC cochléaires à partir d’échantillons témoins et CA-ERBB2. ( A ) Tracés de violon montrant des distributions similaires observées pour les cellules des échantillons témoins et CA-ERBB2 dans le nombre de transcriptions détectées par cellule et dans les dénombrements UMI par cellule utilisés pour générer des bibliothèques de séquençage. À droite, tracé UMAP préliminaire montrant la distribution des cellules CA-ERBB2 et des cellules témoins. Les populations de cellules CA-ERBB2 qui se sont éloignées des cellules témoins sont représentées par une ligne pointillée. ( B ) Clustering initial non biaisé montrant les différences entre les cellules témoins et les cellules CA-ERBB2 dans le nombre de grappes et dans la distribution des cellules au sein des grappes. À droite, graphique à barres montrant la proportion de cellules témoins et CA-ERBB2 trouvées dans chaque cluster. ( C ) Un deuxième clustering impartial distingue les sous-populations des grappes C0, C1 et C2, générant dix grappes uniques ( S0 – S9 ) avec deux grappes formées par des cellules CA-ERBB2 uniquement ( S4 et S7 ) et deux grappes principalement composées de cellules de contrôle ( S2 et S5 ). À droite, graphique à barres montrant la proportion de cellules de contrôle et CA-ERBB2 trouvées dans chaque cluster. Des analyses statistiques ont été effectuées avec le package Seurat dans la version R 4.1.2.
Pour mieux comprendre la diversité transcriptionnelle du SC cochléaire avec signalisation ERBB2 induite, nous avons effectué une résolution de regroupement impartiale ( de 0,6 ) qui a abouti à la distinction des sous-populations au sein des grappes C0, C1 et C2. Dix clusters uniques ( S0 – S9 ) ont été générés avec deux clusters composés de cellules CA-ERBB2 uniquement (Figure 1C). En particulier, en plus du cluster S4 qui correspond à C3 dans le premier clustering impartial, les cellules CA-ERBB2 du cluster C2 ont été distinguées en cluster S7. La plupart des cellules restantes du cluster C2 étaient des cellules de contrôle ( ∼ 80% ) et ont été identifiées comme cluster S2. Un autre cluster représenté principalement par des cellules de contrôle ( ∼ 90% ) est S5, ce qui correspond à C4 lors du premier clustering impartial. Dans les grappes restantes, la distribution des cellules cochléaires Control et CA-ERBB2 était similaire.
Pour évaluer quels SC ont contribué à quels clusters, nous avons gravé l’expression de gènes spécifiques aux sous-types SC, comme décrit pour scRNA-seq de P1 SC (Kolla et al., 2020; Tableau supplémentaire 1 et Figure supplémentaire 4). À la naissance, Fgfr3-iCre peut être exprimé en cellules DC, internes et externes des piliers ( IPC, OPC ), cellules externes des cheveux ( OHC ) et cellules Hensen ( HeC ). Dans notre système, Fgfr3-iCre l’expression est plus clairsemée et l’expression dans HC, DC et HeC est biaisée vers la région apicale, où les cellules sont moins différenciées (Figure supplémentaire 2). Ici, nous avons utilisé l’analyse à 5 clusters, car nous anticipions un nombre similaire de types de cellules. Résultats en Figure 2 montrer que les marqueurs HC Ccer2, Pvalb, et Insm1 sont regroupés dans un sous-ensemble de C2 (Figures 2B, C). Le marqueur HeC Fst est exprimé en C1, alors que Nupr1 est présent en C1 et C2 (Figures 2B, D). Les cinq marqueurs DC, Hes5, Pdzk1ip1, S100a1, Prss23, et Lfng, ont été les plus fortement régulés en C2 (Figures 2B, E). Les fabricants de PC étaient plus ambigus, mais étaient également les plus réglementés en C2 (Figures 2B, F). C4, qui est composé principalement de cellules de contrôle, a exprimé tous les marqueurs examinés à un niveau modéré et n’a donc pas pu être identifié. C0 est un mélange de CA-ERBB2 et de cellules de contrôle, et il exprime une poignée de marqueurs spécifiques au sensoriel, qui étaient S100a1, S100b, et Cryab. Son identité est également ambiguë. C3 est composé exclusivement de cellules CA-ERBB2 et exprime principalement des marqueurs OPC (Figures 2B, F, note Smagp niveaux ). Cependant, il contient également des marqueurs d’identification pour LGER1 ( LGER groupe 1 ), tels que Dcn, Ddost, Pdia6, Rcn3, et Sdf2l1. Ceux-ci sont également enrichis en C1 et C2 (Figure 2G).
Figure 2. Parcelles UMAP et parcelles pour violon pour les transcriptions des gènes marqueurs identifiant les cellules cochléaires. ( A ) Section schématique du conduit cochléaire montrant la position des différents types de cellules. IHC, cellules ciliées internes; OHC, cellules ciliées externes; GER, crête épithéliale supérieure; GRV, cellules frontalières internes; IPH, cellules interphalangiennes; IPC, cellules piliers internes; OPC, cellules piliers externes; DC, Cellules de déitére; Cellules HeC, Hensen. ( B ) Tracé de cluster de Figure 1B, avec des désignations de type de cellule putative. ( C ) Trois marqueurs HC sont présentés: Ccer2, Pvalb, et Insm1. ( D ) Deux marqueurs HeC sont affichés: Fst et Nupr1. ( E ) Les gènes marqueurs suivants ont été utilisés pour identifier les cellules de Deiter: Hes5, Pdzk1ip1, S100a1, Prss23, Lfng. ( F ) Cinq marqueurs pour IPC et OPC sont affichés: Cryab, Emid1, Npy, S100b, et Smagp. ( G ) Cellules GER latérales express Dcn, Ddost, Pdia6, Rcn3, Sdf2l1. Les marqueurs les plus informatifs ont été choisis pour l’affichage. L’identité Cochlear SC associée au gène marqueur analysé est indiquée sur la tracé UMAP. Expression du gène marqueur HeC et OPC Fam159b, et le gène marqueur IHC Acbd7 n’ont pas été détectés.
L’induction de la signalisation ERBB2 dans les cellules CA-ERBB2 peut entraîner l’activation de gènes qui ne sont normalement pas exprimés dans les SC cochléaires. Par conséquent, pour identifier les DEG entre les échantillons de contrôle et CA-ERBB2, nous avons effectué une analyse statistique en utilisant à la fois le test de somme de Wilcoxon et le test de vraisemblance-ratio ( LR ). Dans le test de somme de base de Wilcoxon, les DEG sont identifiés parmi les gènes qui ont un certain niveau d’expression dans les conditions comparées. Le test LR a permis la détection de DEG avec une expression indétectable dans une condition (McDavid et al., 2013). Les gènes ont été cartographiés dans la ressource GO (Figure 3A). Les séquences qui n’ont pas pu être cartographiées dans un enregistrement protéique correspondant dans le système de classification PANTHER ont été désignées “ ID non cartographiés. ” Ils représentent principalement des ARN et des pseudogènes non codants.
Figure 3. Analyse des DEG dans les cellules CA-ERBB2 et des gènes exprimés en amont identifiés dans les grappes S4 et S7. ( A ) Représentation graphique des changements statistiquement significatifs dans l’expression des gènes entre les SC CA-ERBB2 et les SC témoins. Graphiques montrant le nombre de gènes régulés à la hausse et à la baisse dans les cellules CA-ERBB2 identifiés dans le test de somme de Wilcoxon ( top ) et dans le test de rapport de probabilité ( bas ). Dans chaque groupe, les transcriptions de codage protéique sont représentées en gris et l’ARN non codant ( ncRNA ) / pseudogènes est représenté en noir. Les nombres dans la barre indiquent le nombre de transcriptions avec des ID mappés ( codage des protéines ) et des ID non mappés ( ncRNA / pseudogenes ). À droite, les graphiques circulaires pour le test de somme de base de Wilcoxon ( top ) et le test de rapport de probabilité ( bas ) montrant le pourcentage de gènes exprimés différentiellement ( DEG ) trouvés dans jusqu’à 10% des cellules, 10 – 20% des cellules, 20 – 50% des cellules et plus de 50% des cellules. ( B ) Parcelles de volcan montrant la distribution des changements de pli d’expression génique sur le x-axe et p-valeurs pour DEG sur le y-axe identifié dans le test de somme de base de Wilcoxon ( gauche ) et test de rapport de probabilité ( droite ). Les gènes régulés de haut en bas avec des ID mappés dans le système de classification PANTHER sont indiqués dans la parcelle du volcan de test de la somme de Wilcoxon. Les gènes mis en évidence en jaune étaient uniques à ce test. Certains gènes d’intérêt sont indiqués dans la parcelle du volcan à rapport de probabilité. Une liste complète des gènes est fournie dans Tableaux supplémentaires 3, 4. ( C ) Parcelles ponctuels montrant la distribution d’expression des 30 principaux gènes des grappes S4 et S7 parmi tous les grappes. Les points plus sombres ont un niveau d’expression plus élevé, tandis que les points plus grands indiquent que plus de cellules ont exprimé ce gène. Une liste complète des gènes exprimés est fournie dans Tableau supplémentaire 5. ( D ) Analyse d’enrichissement à terme de l’ontologie génétique ( GO ) pour les gènes exprimés des grappes S4 et S7. Les graphiques à barres montrent les 10 principaux termes GO enrichis de processus biologique pour S4 et S7, ainsi que les p-valeurs ( < 0,05 ). Un astérisque ( * ) à côté d’un p-la valeur indique que le terme a également un q-valeur ( < 0,05 ). Le y-axe représente le processus biologique et l’axe horizontal représente le nombre de gènes, qui sont répertoriés sur le côté gauche du graphique. La liste complète des termes est fournie dans Tableau supplémentaire 6.
Utilisation du test de somme de rang Wilcoxon ( adj p < 0,05, logFC > 2 ), 584 DEG ont été identifiés, avec 68 gènes régulés à la hausse et 516 gènes régulés à la baisse (Tableau supplémentaire 3). Environ la moitié des gènes de chaque groupe étaient des ID non cartographiés. Près de 90% des DEG ont été trouvés dans moins de 10% de la population CA-ERBB2. Utilisation du test LR ( adj p < 0,05, logFC > 2 ), 1 556 DEG ont été identifiés (Tableau supplémentaire 4). Au total, 1 049 gènes ont été régulés à la hausse et 507 gènes ont été régulés à la baisse, et environ la moitié d’entre eux étaient des gènes codant pour les protéines (Figure 3A). Environ 64% des DEG ont été trouvés dans moins de 10% de la population de CA-ERBB2. Des parcelles de volcan ont été utilisées pour montrer les DEG pour les deux analyses (Figure 3B). Notez comment l’analyse LR permet d’identifier des DEG très importants comme Wnt10a (Figure 3B à droite ).
Dans les deux analyses, Spp1 figurait parmi les gènes les plus exprimés ( 132 fois changeant ) dans environ 80% des cellules CA-ERBB2, par rapport à l’expression de Spp1 dans 55,4% des cellules de contrôle. Spp1 sera décrit plus en détail plus loin. Lama3 figurait parmi les gènes les plus régulés à la baisse dans les cellules CA-ERBB2 dans les deux tests. Il a été détecté dans 3,4% des cellules CA-ERBB2, contre 23,2% des cellules de contrôle. LAMA3 est une sous-unité de laminines, qui assurent la médiation de la fixation, de la migration et de l’organisation des cellules en interagissant avec les récepteurs de l’intégrine et d’autres composants de la matrice extracellulaire ( ECM ) (Belkin et Stepp, 2000; Hamill et al., 2010). Dans le test LR, Kyphoscoliose peptidase (KyLe gène ) est le plus haut différentiellement exprimé ( 3530 fois ), mais seulement dans environ 7,3% des cellules CA-ERBB2, contre 21,5% des cellules témoins. La fonction proposée par KY est le maintien du cytosquelette et de la jonction neuromusculaire (Hedberg-Oldfors et al., 2016). Ces données suggèrent que certaines cellules CA-ERBB2 modifient l’environnement local, ce qui pourrait affecter le comportement des cellules voisines.
Pour mieux comprendre l’hétérogénéité transcriptionnelle des cellules CA-ERBB2 dans les grappes S4 et S7, nous avons identifié des gènes régulés vers le haut dans chaque grappe décrit dans Figure 1C, puis examiné les voies activées par rapport à la base de données des processus biologiques GO. Pour chacun des 10 clusters, nous avons analysé l’expression des gènes par rapport aux clusters restants. Utilisation des critères d’un ajusté p-valeur de < 0,05 et différence de niveaux d’expression supérieure à deux fois, nous avons trouvé 90 gènes exprimés dans le cluster S4 et 1102 gènes dans le cluster S7. L’expression de trente gènes supérieurs exprimés identifiés dans les grappes S4 et S7 par rapport à d’autres grappes est indiquée dans Figure 3C. Pour les grappes restantes, qui sont composées de cellules de contrôle et CA-ERBB2 ( à l’exception du cluster S5 ), nous avons constaté que S0 avait 1125 gènes exprimés, S1 – 810, S2 – 731, S3 – 359, S5 – 3722, S6 – 484, S8 – 426 et S9 – 144 (Tableau supplémentaire 5). Les 10 principaux gènes exprimés dans chaque cluster ont ensuite été utilisés pour générer des thermopuets (Figure supplémentaire 5).
L’analyse a révélé que parmi les gènes les plus exprimés dans le cluster S4, il y a les DEG identifiés dans le test de somme de Wilcoxon (Spp1, CD63, Tmsb4x; Figure 3B et Tableau supplémentaire 3), et dans le test LR (Spp1, Timp1, Dmp1, Mmp9, CD63; Figure 3B et Tableau supplémentaire 4). Selon la carte thermique, S4 n’était lié à aucun autre cluster (Figure supplémentaire 5). En revanche, le cluster S7, composé uniquement de cellules CA-ERBB2, avait certains gènes régulés vers le haut en commun avec des gènes régulés vers le haut dans le cluster S2, qui était principalement des cellules de contrôle. Cela suggère que les cellules CA-ERBB2 du cluster S7 proviennent de la même population que les cellules de contrôle du cluster S2. Parmi les gènes de S7 les plus exprimés, il y a les DEG identifiés dans le test LR (Plet1os, Rufy4, Plet1, Cutal) (Figure 3B et Tableau supplémentaire 4).
En ce qui concerne les grappes composées à la fois de CA-ERBB2 et de cellules de contrôle, certaines relations transcriptionnelles étaient également évidentes (Figure supplémentaire 5). Par exemple, le cluster S6 présentait des similitudes avec le cluster S1, qui se trouve à proximité sur l’analyse UMAP. Aucun gène marqueur n’a été exprimé dans les grappes S0, S3 et S5. Étonnamment, dans le groupe S5 composé principalement de cellules de contrôle, un certain niveau de régulation ascendante a été observé pour la plupart des gènes exprimés identifiés dans d’autres groupes, à l’exception des gènes du cluster S8. Enfin, les grappes S8 et S9 sont représentées par un petit nombre de cellules avec des gènes exprimés en amont généralement introuvables dans d’autres grappes, ce qui indique qu’il s’agit de populations transcriptionnellement distinctes. Cette analyse souligne la diversité des réponses des CS à l’expression CA-ERBB2.
En résumé, CA-ERBB2 a entraîné les plus grands changements transcriptionnels dans une minorité de cellules, présumées être des DC et des PC. Les cellules répondant à CA-ERBB2 ont modifié l’expression de centaines de transcriptions distinctes. Nous nous sommes concentrés sur ces changements pour identifier les corrélats des effets indirects de l’expression CA-ERBB2 sur les cellules voisines.
Une analyse d’enrichissement de l’ensemble génétique contre le processus biologique GO a été réalisée pour les gènes exprimés en amont des grappes S4 et S7 afin d’identifier les voies moléculaires répondant à l’activation ERBB2 (Figure 3D). Pour les autres clusters, les résultats avec les 10 principaux termes GO répertoriés avec q-valeur < 0,05 sont en Figure supplémentaire 6, et la liste complète des termes pour tous les clusters est fournie dans Tableau supplémentaire 6. Parmi les annotations les plus enrichies, toutes deux ajustées p-valeur et nombre de gènes impliqués, étaient des annotations de gènes liés à la modulation de l’ECM. Le cluster distinctif S4, formé entièrement par des cellules CA-ERBB2, a montré divers degrés d’activation des marqueurs impliqués dans l’organisation de la matrice extracellulaire ( GO: 0030198 ), et le démontage de la matrice extracellulaire ( GO: 0022617 ). Le cluster S4 avait également enrichi les gènes associés à la réponse cellulaire au stimulus cytokin ( GO: 0071345 ), voie de signalisation médiée par la cytokine ( GO: 0019221 ) et régulation de la voie de signalisation médiée par l’intégrine ( GO: 200101010101. Nous notons que les grappes S1 et S6 ont également été distinguées par des gènes exprimés impliqués dans l’organisation et le démontage de la matrice extracellulaire.
En ce qui concerne le cluster S7 distinctif des cellules CA-ERBB2, l’analyse du processus biologique GO n’a pas révélé de termes avec q-valeur < 0,05 (Figure 3D). Cependant, parmi les termes importants p-valeur ( < 0,05 ), sont des termes associés à des gènes Krt17 et Plet1 répertoriés comme DEG dans le test LR (Figure 3B et Tableau supplémentaire 4). Le développement de l’épiderme ( GO: 0008544 ) est associé à Krt17 et Col7a1 gènes. Ce terme est dans une relation parent-enfant avec le terme lié à la différenciation HC ( différenciation des cellules auditives de l’oreille interne, GO: 0042491 ). De plus, Plet1 est associé à la cicatrisation des plaies, à la propagation des cellules épidermiques ( GO: 0035313 et GO: 0044319 ), et à la régulation négative de l’adhérence à la matrice cellulaire ( GO: 0001953 ) (Tableau supplémentaire 6).
Dans les grappes S1, S2 et S6, les cellules CA-ERBB2 ont été mélangées avec des cellules de contrôle suggérant qu’elles ont un transcriptome similaire. Les termes GO identifiés pour ces groupes indiquent que les cellules cochléaires de souris P3 subissent toujours des changements liés au développement de l’organe de Corti (Figure supplémentaire 6). Par exemple, les cellules du groupe S1 ont été enrichies de gènes associés à la morphogenèse des organes sensoriels ( GO: 0090596 ), organisation de fibrilles de collagène ( GO: 0030199 ), régulation de la migration des cellules endothéliales ( GO: 001010594 : : 1010010101094 >, différenciation des cellules endodermiques ( GO: 0035987 ) et développement du système squelettique ( GO: 0001501 ). Dans le groupe S2, les cellules ont montré une régulation ascendante des gènes impliqués dans le développement des cellules épithéliales ( GO: 0002064 ), une régulation de la transcription impliquée dans l’engagement de devenir cellulaire ( GO: 0060850 ), et une voie de signalisation NOTCH ( GO:0007219 ). Dans le cluster S6, les gènes enrichis sont associés à la perception sensorielle du stimulus mécanique ( GO: 0050954 ), et à la perception sensorielle du son ( GO: 0007605 ).
Les cellules du cluster S8 ont été enrichies de termes associés à la division cellulaire. L’analyse des transcriptomes pour l’expression génique spécifique au cycle cellulaire a confirmé que les cellules du cluster S8 sont en phase S et G2 / M (Chiffres supplémentaires 6, 7). L’analyse a également révélé que, alors que la plupart des cellules à travers les conditions étaient en phase G1, les grappes S4 et S0 ont également montré un enrichissement des cellules en phase S et G2 / M, indiquant certaines cellules préparées ou ayant subi une division cellulaire (Figure supplémentaire 7). Dans le cluster S8, les cellules CA-ERBB2 et les cellules de contrôle ont montré des marqueurs pour les phases S et G2 / M, cependant, dans le cluster S0, cette population était principalement représentée par les cellules CA-ERBB2.
Ensemble, ces résultats indiquent que les changements transcriptionnels induits par les cellules CA-ERBB2 incluent le de novo expression des cytokines et des gènes de la voie de signalisation. Beaucoup devraient moduler la matrice extracellulaire et affecter la différenciation, favorisant la prolifération dans une minorité de cellules.
Comme l’un des objectifs de cette étude était d’identifier les voies de signalisation secondaires candidates qui pourraient agir en aval de la signalisation ERBB2, nous nous sommes concentrés ensuite sur la nouvelle population de cellules CA-ERBB2 qui formaient un cluster S4 transcriptionnellement distinct. Gènes à haut régulation Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1, se trouvent dans les annotations GO associées à la modulation de l’ECM et de la réponse à la cytokine (Figure 3D). À l’aide du logiciel STRING, nous avons analysé le réseau d’interaction protéine-protéine pour SPP1, TIMP1, MMP9 et DMP1. Les résultats sont visualisés dans Figures 4A – D, et les scores des interactions prévues sont résumés dans Tableau 1. L’analyse montre que les interactions entre SPP1, TIMP1, MMP9 et DMP1 ont des scores d’association dans la plage de confiance élevée et la plus élevée ( scores supérieurs à 0,7 et 0,9, respectivement ). L’augmentation du réseau de cinq protéines supplémentaires a révélé que le CD44 était une protéine étroitement associée (Figure 4B), avec le score de confiance le plus élevé ( supérieur à 0,9 ) calculé pour SPP1, TIMP1 et MMP9, indiquant des associations vrais probables. Cinq protéines supplémentaires ajoutées au réseau ont révélé deux protéines qui ont été trouvées comme étant différenciées entre CA-ERBB2 et les cellules de contrôle (Figure 4C). Ces protéines étaient CD63 et HPX, et les deux ont des scores d’association dans la plage de confiance la plus élevée ( au-dessus de 0,9 ) avec TIMP1; alors que HPX a également un score d’association dans la plage de confiance élevée ( supérieur à 0,7 ) avec MMP9.
Figure 4. Réseau d’interaction protéine-protéine STRING de quatre gènes régulés par le haut dans le cluster S4. ( A ) Connectivité du réseau d’interaction protéine-protéine entre SPP1, TIMP1, MMP9 et DMP1. Dans ( B, C ) les réseaux de protéines-protéines sont représentés avec un nombre croissant de gènes étroitement associés. Un bord a été dessiné avec des lignes colorées représentant un type de preuve utilisé pour prédire les associations. Une ligne violette indique des preuves expérimentales; une ligne vert clair indique des preuves d’extraction de texte; une ligne bleu clair indique des preuves de base de données; une ligne noire indique des preuves de co-expression; et une ligne violet clair indique l’homologie des protéines. Les interactions des scores sont résumées dans Tableau 1. Dans ( D ) Tracé UMAP avec cluster S4 marqué enrichi en cellules exprimant Spp1, Timp1, Mmp9 et Dmp1 en réponse à l’induction de la signalisation ERBB2. Dans ( E ) Parcelles UMAP et parcelles de violon divisées montrant l’expression régulée de Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1 en CA-ERBB2 par rapport aux cellules de contrôle de différents groupes. ( F ) Validation RT-qPCR de l’analyse scRNA-seq effectuée sur les cellules GFP + triées FACS de P3 cochleae. Le niveau d’expression des gènes dans l’échantillon CA-ERBB2 est présenté comme une valeur ΔΔCt ( ± SD ) par rapport au contrôle ( CTRL ) normalisé par rapport à l’expression des deux gènes de référence Eef1a1 ( E ) et Tubb4a ( T ) (n = 3 ). Importance (*p < 0,05; **p < 0,01 ) a été déterminé par non apparié t-test ( UNE – TAILED ) analyse.
Tableau 1. Le score combiné des interactions entre les paires de protéines dans l’analyse de la base de données STRING.
SPP1 et DMP1 sont de petites glycoprotéines n-liées à liaison à l’intégrine ( SIBLING ), qui sont des ligands sécrétés pour les récepteurs CD44 et αvβ3 à l’intégrine. Ils favorisent la survie, la prolifération, la différenciation et la migration dans différents systèmes (Flores et al., 1992; Ashkar et al., 2000; Sodek et al., 2000; Denhardt et al., 2001; Jain et al., 2002; Karadag et al., 2005; Rangaswami et al., 2006; Kazanecki et al., 2007; Wu et al., 2011). TIMP1 inhibe MMP9, une métallopeptidase qui module les deux CD44 (Visse et Nagase, 2003; Grunwald et al., 2019) et signalisation NOTCH (Garg et al., 2010). Le récepteur CD44 a un rôle dans la survie cellulaire et la prolifération dans le développement du cancer, mais une découverte récente met également en évidence son rôle important dans la régénération tissulaire et la cicatrisation des plaies (Denhardt et al., 2001; Kyriakides et al., 2009; Kim et al., 2012; Michopoulou et al., 2020). Notamment, le CD44 est exprimé de manière endogène sur les OPC chez la souris à l’âge adulte (Hertzano et al., 2010).
Analyse des parcelles UMAP et violon divisé pour Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1 indique que la montée en puissance de ces gènes est observée dans les cellules CA-ERBB2 pour la plupart des grappes, avec un enrichissement significatif dans le cluster S4 (Figure 4E). Les cellules de contrôle expriment des niveaux inférieurs de Spp1 et Timp1 gènes, en particulier dans les grappes S1, S5 et S6. Pour les gènes Mmp9 et Dmp1, presque aucune expression n’est détectée dans les cellules de contrôle, à l’exception des grappes S9 et S5. Pour valider l’analyse scRNA-seq, nous avons effectué une réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcriptase inverse ( RT-qPCR ) sur des cellules GFP cochléaires triées FACS + collectées auprès de souris néonatales CA-ERBB2 et Control. Les résultats de l’analyse RT-qPCR sont présentés dans Figure 4F. Ils confirment que l’activation de la signalisation ERBB2 dans les cellules CA-ERBB2 a entraîné une expression significative régulée à la hausse des gènes Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1, ainsi que d’autres gènes identifiés comme exprimés dans les cellules CA-ERBB2 du cluster S4 (Bglap, Bglap2, Ptgis, Cd63, Il12a, Anche) (Figure supplémentaire 8 et Figure 3C). Ces résultats confirment que le réseau de protéines SIBLING est en effet induit par l’expression CA-ERBB2 dans les SC au stade néonatal.
Déterminer si l’amas SIBLING pourrait être induit aux stades adultes, nous avons utilisé l’immunostatation sur des sections de cochlée de jeunes souris adultes après une combinaison de perte auditive induite par des dommages et d’induction de CA-ERBB2. Les jeunes souris mâles et femelles avec le génotype Control et CA-ERBB2 ont été exposées au bruit traumatique comme décrit dans les méthodes (Figure 5A). 3 jours après l’exposition au bruit ( 3 DPN ), les souris des deux génotypes ont été assignées au hasard à deux groupes et traitées avec une injection de doxycycline ( DOX ) pour initier l’expression CA-ERBB2; ou avec injection de solution saline à utiliser comme référence. Les souris ont été euthanasiées à 5 DPN, et leur cochlée a été disséquée et traitée pour immunostication avec des anticorps spécifiques au SPP1, au TIMP1 et au domaine intracellulaire du récepteur CD44.
Figure 5. SPP1 et TIMP1 ainsi que la signalisation CD44 sont régulés à la hausse dans les cellules cochléaires 2 jours après l’induction CA-ERBB2 chez les jeunes adultes exposés au bruit. ( A ) Chronologie de l’exposition au bruit ( NE ), activation GFP ( TAM ), activation CA-ERBB2 ( DOX ) et tests auditifs ( HT ) chez les jeunes souris adultes. Les souris ont été exposées à un bruit de bande d’octave de 110 dB pendant 2 h et 3 jours plus tard, injectées de doxycycline ( DOX ) pour induire l’expression CA-ERBB2. HT a été exécuté 1 DPN pour confirmer la perte auditive. L’immunostatation des sections de cochlée a révélé la détection du SPP1 ( B ) et TIMP1 ( C )avec récepteur CD44 activé chez les animaux CA-ERBB2. L’immunodétection pour les HC ( PVALB, rouge ), et les cellules compétentes pour exprimer CA-ERBB2 ( GFP, vert ), sont indiquées dans les panneaux 1 et 2. L’immunodétection du récepteur CD44 activé ( bleu ) est indiquée dans les panneaux 1 et 3. L’immunodétection de SPP1 et TIMP1 est indiquée dans les panneaux 1, 3 et 4 ( gris ).
Comme indiqué dans Figures 5B, C, SPP1 et TIMP1 ont été exprimés en sections cochléaires d’animaux CA-ERBB2 traités par DOX. L’immunoréactivité fluorescente pour SPP1 correspondait aux cellules GFP +, y compris les cellules proches de l’OHC qui correspondent au DC et les cellules proches de l’IHC correspondant aux cellules phalangiennes et aux cellules frontalières. De même, le TIMP1 a été détecté dans les cellules GFP +, bien que dans les sections des animaux témoins, l’immunoréactivité pour le TIMP1 était également évidente dans les cellules correspondant aux cellules phalangiennes internes et aux cellules frontalières. La coloration du domaine intracellulaire CD44 a montré une régulation clairement ascendante de la signalisation CD44 dans les cellules GFP + des animaux CA-ERBB2 traités par DOX. L’immunoréactivité CD44 a également été observée dans les cellules interphalangiennes, DC et également dans les cellules correspondant aux cellules HeC ou Claudius. Fait intéressant,L’activation du CD44 dans les cellules correspondant aux cellules HeC ou Claudius était également évidente dans les sections des animaux témoins. Ceci est cohérent avec le rapport précédent décrivant l’expression de CD44 pour augmenter le nombre de souris postnatales par P7 dans les OPC, les cellules de Claudius et dans un petit nombre de cellules GER (Hertzano et al., 2010).
Des souris supplémentaires exposées au bruit traumatique, à l’EdU et à la doxycycline ont été euthanasiées à 7 DPN et analysées pour l’expression GFP et des marqueurs supplémentaires (Figure 6). Nous avons constaté ici que les cellules GFP + et GFP négatives étaient situées dans le milieu scala de CA-ERBB2 cochlea. La phosphorylation de l’ERBB2 a été observée dans des cellules dispersées et n’a pas cartographié avec précision l’expression de GFP comme observé à des moments antérieurs (Zhang et al., 2018). Les chiffres mitotiques étiquetés avec EdU étaient évidents dans ces agrégats (Figure 6B ’), tout comme les cellules dispersées étiquetées avec CASP3 activé (Figure 6C ’). Cellules dispersées dans les agrégats exprimés des marqueurs sensoriels, y compris MYO7 (Figure 6B ’) et le marqueur SC TAK1 (Figure 6D ’). Ils étaient largement absents de SOX2 (Figure 6A ’) et PVALB (Figure 6D ’expression ). Certains agrégats avaient des régions multicellulaires lisses et compactées qui se collaient brillamment pour la phalloïdine. Des agrégats ont été observés dans quatre cochléés sur cinq avec induction CA-ERBB2. Dans 4 cochléaires témoins, seuls de très petits groupes de cellules ont été observés flottant dans le conduit cochléaire, dont aucun n’a exprimé de GFP ou incorporé EdU (Figures 6E, E ’, flèches ). Ces données sont cohérentes avec l’interprétation selon laquelle l’activation de la signalisation CA-ERBB2 chez les jeunes souris adultes après des dommages peut également induire l’expression de certains membres du réseau de protéines SIBLING. Ils suggèrent également que les SC tracés en lignée peuvent répondre à l’expression de CA-ERBB2 en sortant de l’épithélium.
Figure 6. Quatre jours après l’induction de CA-ERBB2, des agrégats de cellules sensorielles peuvent être trouvés dans le conduit cochléaire. Haut, chronologie de l’exposition au bruit ( NE ), activation GFP ( TAM ), activation CA-ERBB2 ( DOX ), injection EdU et tests auditifs ( HT ) chez les jeunes adultes souris. Les images de faible puissance de Brightfield sont utilisées pour montrer la position des agrégats cellulaires, tandis que l’immunostaining révèle des marqueurs spécifiques. ( A, A ’ ) GFP ( vert ) et pERBB2 ( magenta ) sont présents dans un agrégat attaché au limbe en spirale, qui a peu de SOX2 ( blanc ). ( B, B ’ ) Un agrégat de même localisation héberge des cellules GFP + ( vert ) et des cellules MYO7 + rares ( blanc ), avec des figures mitotiques EdU + ( magenta ) dans des cellules dépourvues de GFP. ( C, C ’ ) Un agrégat près de la strie vasculaire contient des cellules GFP + ( vert ), des cellules apoptotiques rares marquées d’un CASP3 anti-activé ( magenta ) et des cellules épithéliales compactées révélées par coloration à la phalloïdine ( blanc. ( D, D ’ ) Un autre agrégat près des cellules des ports stries vasculaires avec GFP ( vert ) et cellules voisines positives pour le marqueur cellulaire de soutien TAK1 ( magenta ), mais pas de PVALB + HCs. ( E, E ’ ) Une souris de contrôle dépourvue de transgène CA-ERBB2 ne héberge que de petits groupes de cellules ( flèche jaune ) sans expression GFP.
Auparavant, nous avons constaté que les SC avec une expression génique activée ERBB2 chez leurs voisins in vivo et a favorisé la différenciation des cellules semblables aux cellules ciliées, suggérant que ERBB2 peut initier une cascade de signalisation importante pour la régénération HC (Zhang et al., 2018). Ici, l’analyse du transcriptome unicellulaire a révélé la formation d’une nouvelle population parmi un sous-ensemble de cellules avec signalisation ERBB2 activée, qui s’était considérablement différenciée des cellules de contrôle parentales. Peut-être dérivées d’OPC, ces cellules expriment également des gènes spécifiques à LGER. Ils comprennent la plupart des cellules exprimant Spp1, identifié dans nos études comme l’un des gènes les plus activés en réponse à la signalisation ERBB2. Surtout, dans cette nouvelle population, nous voyons l’expression des trois autres gènes à régulation ascendante, Mmp9, Timp1, et Dmp1. Ensemble avec Spp1, ils sont associés à un réseau de signalisation impliquant des récepteurs CD44 et integrine αvβ3. L’analyse d’enrichissement GO a révélé que ces gènes modulent à la fois les réponses ECM et cytokine, y compris la signalisation Notch. Nous avons confirmé que les protéines SPP1, TIMP1 et CD44 sont également régulées à la hausse dans les SC cochléaires adultes après l’induction de CA-ERBB2. Par la suite, nous avons observé la formation d’agrégats flottants de cellules sensorielles cochléaires. Le sort et le potentiel de ces agrégats cellulaires ne sont pas connus.
SPP1 et DMP1 sont des glycoprotéines sécrétées qui agissent comme des ligands pour les récepteurs CD44 et αvβ3 d’intégrine. Ils sont membres de la petite famille de glycoprotéines n-liées au ligand de liaison à l’intégrine ( SIBLING ). SPP1 favorise la survie, la prolifération, la différenciation, l’adhésion et la migration de nombreux types de cellules (Flores et al., 1992; Ashkar et al., 2000; Sodek et al., 2000; Denhardt et al., 2001; Jain et al., 2002; Karadag et al., 2005; Rangaswami et al., 2006; Kazanecki et al., 2007). Bien que la fonction DMP1 dans les blessures et la cicatrisation des plaies n’ait pas encore été déterminée, elle est significativement régulée à la hausse dans un certain nombre de tissus cancéreux (Chaplet et al., 2003; Fisher et al., 2004). SPP1 peut fonctionner dans la différenciation neuronale des neurones auditifs pendant le développement de l’oreille interne (Kim et al., 2014). De plus, il est détecté dans le labyrinthe membraneux des cochléaires de mammifères adultes, en particulier dans l’utricule, où il est actuellement utilisé comme marqueur de type I HC (Lopez et al., 1995; Sakagami, 2000; McInturff et al., 2018; Jan et al., 2021).
L’aspect le plus important de la régulation ascendante des SPP1, MMP9 et TIMP1 en réponse à la signalisation ERBB2, c’est qu’ils favorisent la cicatrisation et la régénération des plaies après une blessure dans d’autres systèmes (Denhardt et al., 2001; Kyriakides et al., 2009; Kim et al., 2012; Michopoulou et al., 2020). SPP1 est bien connu pour arbitrer la régénération osseuse et musculaire (Uaesoontrachoon et al., 2008; Zanotti et al., 2011; Pagel et al., 2014; Maeda et al., 2017; Zhu et al., 2020), et il est également impliqué dans la promotion de la prolifération et de la régénération du système nerveux (Ellison et al., 1998; Hedtjarn et al., 2004; Liu et al., 2017). Dans des études récentes, Wang et al. a démontré que la liaison du SPP1 avec le CD44 et l’intégrine αvβ3 est importante dans la fonction des cellules de Schwann dans la régénération des nerfs, en favorisant la prolifération et la survie après une lésion nerveuse périphérique (Wang et al., 2020). Une autre étude de Powell et al. ( 2019 ) a montré que le SPP1 avec le MMP9 agit par le biais du récepteur CD44 pour arbitrer la synaptogenèse après l’insulte du système nerveux central ( CNS ).
TIMP1 est un inhibiteur de MMP9 et l’équilibre entre eux est un régulateur clé du réseau de signalisation dans le nerf blessé (Kim et al., 2012) et favorise le processus de guérison de la peau fœtale brûlée (Yu et al., 2017). La régulation ascendante de TIMP1 pourrait expliquer la régulation généralisée de SOX2 après la signalisation CA-ERBB2 in vivo (Zhang et al., 2018), car MMP9 est nécessaire pour la signalisation NOTCH (Zhao et al., 2016), et NOTCH est nécessaire et suffisant pour promouvoir l’expression SOX2 (Pan et al., 2013). Un rapport MMP9 / TIMP1 accru favorise la dégradation de l’ECM pour permettre la migration cellulaire, tandis qu’un rapport MMP9 / TIMP1 réduit stimule la reconstruction de l’ECM pendant le processus de guérison (Yu et al., 2017). TIMP1 peut également agir comme cytokine indépendamment de l’inhibition de MMP9 pour favoriser la survie et la prolifération des cellules (Ries, 2014). Dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, le TIMP1 favorise la migration, l’adhésion et la survie en se liant au complexe de récepteurs β1 à l’intégrine CD63 (Wilk et al., 2013). Notre analyse scRNA-seq a révélé le CD63 sous forme de DEG et sa régulation ascendante a été principalement enrichie en cluster S4 formé par des cellules CA-ERBB2 (Tableaux supplémentaires 3, 4).
La régulation à la hausse des SPP1, MMP9, TIMP1 et DMP1 en réponse à l’activation ERBB2 suggère que sa signalisation en aval implique un récepteur CD44 et potentiellement également des récepteurs d’intégration. La relation entre ERBB2 et CD44 a été décrite précédemment pour maintenir les interactions neuronales – cellules de Schwann dans le développement des nerfs néonataux précoces du rat (Sherman et al., 2000). En particulier, le CD44 a considérablement amélioré la phosphorylation ERBB2 induite par la néureguline et l’hétérodimérisation ERBB2 – ERBB3. Le CD44 s’est également révélé interagir avec le récepteur ERBB2 (Bourguignon et al., 1997; Sherman et al., 2000). L’importance du réseau des récepteurs CD44 dans la survie, la prolifération et la régénération des cellules décrites pour les cellules de Schwann et dans d’autres tissus suggère que certains des effets CA-ERBB2 impliquent la signalisation via le récepteur CD44.
Une flexibilité moindre de l’épithélium associé à la jonction cellule-cellule a été proposée comme l’un des mécanismes responsables de la diminution de la capacité de régénération de la cochlée de mammifère adulte (Burns et al., 2008). Nos résultats indiquent que la signalisation ERBB2 favorise la modulation de l’ECM qui permettrait une flexibilité accrue dans l’organe de Corti. La combinaison d’inhibiteurs de l’EGF et de la GSK3 a récemment été signalée comme appauvrissant la cajérine E dans des jonctions serrées de la cochlée de mammifères adultes (Kozlowski et al., 2020). En plus des gènes régulés à la hausse associés au démontage ECM dans le cluster S4, il existe également une régulation à la hausse Plet1 gène dans les cellules CA-ERBB2 du cluster S7, qui est associé à une régulation négative de l’adhérence à matrice cellulaire ( GO: 0001953 ). Plet1est répertorié en termes GO associés à la propagation des cellules et à la cicatrisation des plaies ( GO: 0035313, GO: 0044319 ). Ainsi, nous prédisons que sa régulation ascendante permettrait une augmentation des mouvements locaux de cellules.
L’importance de la modulation ECM médiée par ERBB2 pour la régénération des HC est également soutenue par des études récentes indiquant que les récepteurs ECM et d’intégrine sont induits dans le développement neurosensoriel précoce et la détermination du devenir cellulaire dans le fœtus humain oreille interne (Johnson Chacko et al., 2021). Nous spéculons que l’activation forcée des voies de signalisation à travers les récepteurs de la famille ERBB pourrait permettre des changements dans l’environnement de l’organe de Corti qui favorisent la prolifération des SC et permettent la régénération des HC. Des études antérieures ont montré peu ou pas d’activité des cellules souches chez la cochlée de mammifères adultes (Oshima et al., 2007; Senn et al., 2020). Cela contraste avec la capacité robuste en forme de tige dans les cellules isolées de l’utricule adulte (Li et al., 2003; Senn et al., 2020), qui est en corrélation avec un potentiel de régénération limité dans cet organe (Burns and Stone, 2017). Ces données peuvent être interprétées comme signifiant que les cellules souches cochléaires, résidant peut-être dans le RGO (Udagawa et al., 2021), sont perdus pendant la maturation. Il est également possible que leurs exigences de survie ou de maintien de l’identité diffèrent. Par exemple, ils peuvent nécessiter des cellules accessoires pour maintenir leur niche microenvironnementale. Alternativement, l’expression forcée de la signalisation CA-ERBB2 pourrait promouvoir de nouveaux comportements non visibles autrement dans les SC cochléaires.
En conclusion, nous rapportons que la signalisation forcée d’ERBB2 dans une minorité de SC cochléaires entraîne une nouvelle réponse de différenciation dans la cochlée de souris néonatale. Ces cellules induisent l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans la signalisation, la cicatrisation des plaies et la migration. Nous confirmons qu’au moins deux de ces gènes, SPP1 et CD44, sont également régulés à la hausse dans les cellules cochléaires adultes après l’induction de CA-ERBB2. L’induction CA-ERBB2 est également en corrélation avec la génération d’agrégats cellulaires dans le conduit cochléaire. Ces agrégats contiennent, mais sans s’y limiter, des cellules CA-ERBB2 cartographiées par le devenir. Leur potentiel, leurs effets et leur sort restent à déterminer.
Les données présentées dans cette étude sont déposées dans le référentiel de données Gene Expression Omnibus, numéro d’accès: GSE202850 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE202850). Les données d’image disponibles à partir de: https://osf.io/r9cbq/.
Cette étude sur les animaux a été examinée et approuvée par le Bureau d’examen des soins et de l’utilisation des animaux, Département de la défense, et le Comité universitaire de recherche sur les animaux, Université de Rochester.
DP-P: administration de projet, enquête, méthodologie, conservation des données, analyse formelle, visualisation, rédaction – ébauche et révision originales et édition. DN et CB: conservation des données, analyse formelle, logiciel, visualisation et révision et édition –. JZ: méthodologie, enquête, visualisation et rédaction – examen et édition. JA: conceptualisation, supervision, ressources et rédaction – examen et édition. PW: conceptualisation, acquisition de financement, ressources, supervision, analyse formelle et révision et édition de –. Tous les auteurs ont contribué à l’article et approuvé la version soumise.
Ce travail a été financé par les États-Unis. Mécanisme de recherche médicale de l’armée ( W81XWH2010515 ) ( numéro de subvention: RH190035 ), Institut national sur la surdité et les autres troubles de la communication ( numéros de subvention: R01 DC014261 et R01 DC018660 ) et le programme Schmitt sur les neurosciences intégratives.
Nous reconnaissons avec reconnaissance le Dr. Anne Luebke, qui possède le noyau de test auditif pour petits animaux de l’URMC; Dr. Jian Zuo pour la souche de souris Fgfr3-iCre; Dr. Lin Gan pour la souche de souris rtTA / GFP floxed ROSA; et Dr. Amy Kiernan pour des conseils sur l’interprétation expérimentale et pour la lecture critique du manuscrit.
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Toutes les affirmations exprimées dans cet article sont uniquement celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement celles de leurs organisations affiliées, ni celles de l’éditeur, des rédacteurs en chef et des examinateurs. Tout produit qui peut être évalué dans cet article, ou allégation qui peut être faite par son fabricant, n’est pas garanti ou approuvé par l’éditeur.
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Mots-clés: régénération cochléaire, voie candidate, ERBB2, séquençage unicellulaire, SIBLING, CD44
Citation: Piekna-Przybylska D, Na D, Zhang J, Baker C, Ashton JM et White PM ( 2023 ) L’analyse de séquençage à ADN unicellulaire des transcriptomes de cellules cochléaires de souris avec récepteur ERBB2 activé indique une réponse spécifique à la cellule qui favorise l’activation du CD44. Devant. Cellule. Neurosci. 16: 1096872. doi: 10.3389 / fncel.2022.1096872
Reçu: 12 novembre 2022; Accepté: 12 décembre 2022;
Publié: 06 janvier 2023.
Édité par:
Chen Chen, Université de Stanford, États-Unis
Révisé par:
Ping-Chung Chen, St. Jude Children’s Research Hospital, États-Unis
Robert J. Morell, Institut national sur la surdité et les autres troubles de la communication ( NIH ), États-Unis
Copyright © 2023 Piekna-Przybylska, Na, Zhang, Baker, Ashton et White. Il s’agit d’un article en libre accès distribué selon les termes de la Licence d’attribution Creative Commons ( CC BY ). L’utilisation, la distribution ou la reproduction dans d’autres forums sont autorisées, à condition que l’auteur original ( s ) et le propriétaire des droits d’auteur ( s ) soient crédités et que la publication originale de cette revue soit citée, conformément à la pratique académique acceptée. Aucune utilisation, distribution ou reproduction n’est autorisée qui ne respecte pas ces termes.
*Correspondance: Patricia M. Blanc, 
patricia_white@urmc.rochester.edu
†Adresse actuelle: Jingyuan Zhang, Département d’oto-rhino-laryngologie, Boston Children’s Hospital, Boston, MA, États-Unis
Avertissement: Toutes les affirmations exprimées dans cet article sont uniquement celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement celles de leurs organisations affiliées, ni celles de l’éditeur, des rédacteurs en chef et des examinateurs. Tout produit qui peut être évalué dans cet article ou prétendre être fabriqué par son fabricant n’est ni garanti ni approuvé par l’éditeur.
https://stratpol.com/bilan-des-pertes-de-guerre-russie-otan-en-ukraine/
S’agissant de bilans de pertes donnés par les États-majors, il faut toujours être très prudent compte tenu de la propagande de guerre menée par les deux camps pour ne pas affoler les populations. Toutefois, je vous communique le bilan ci après qui me semble tout à fait plausible parce que la disproportion entre les pertes ukrainienne et russe est tout à fait cohérente avec la disproportion des feux appliqués par chacun des camps à son adversaire.
Aujourd’hui, il y a consensus pour dire que la Russie à une supériorité des feux de l’ordre d’au moins 8 pour 1, que ce soit les feux d’Artillerie, les feux des missiles de croisière, les feux aériens air- sol et les feux sol-air de protection.
Il y a, en outre, supériorité aérienne Russe et supériorité écrasante russe dans la guerre des drones. Cette supériorité permet d’accroître la précision et l’efficacité des feux de toute nature.
Rien d’étonnant à ce que l’écart des pertes soit de 1 pour 8 en faveur de la Russie parce que c’est le feu qui tue et qui détruit et que la disproportion du feu est de l’ordre de 8 pour 1 en faveur de la Russie.
L’édition turque de Hürseda Haber publie des informations sur les pertes de l’Ukraine lors de l’opération spéciale. Ces informations seraient basées sur des données du MOSSAD israélien. Ces bilans me semblent crédibles et sont probablement proches de la réalité.
Bien sûr, le site ORYX et les bla-blateurs de plateaux télé qui participent à la propagande ukro-atlantiste en évoquant les “effroyables” pertes russes vont en être pour leur frais. Les chiffres qu’ils évoquaient étaient d’ailleurs totalement incohérents avec le différentiel des feux tel qu’il est unanimement reconnu. N’importe quel militaire digne de ce nom pouvait s’en apercevoir…
Fait intéressant, ces données ont été rendues publiques par les médias turcs, mais avec une référence aux services de renseignement israéliens.
Source: Hurseda Haber ; Traduction : Sylvain FERREIRA
https://stratpol.com/bilan-des-pertes-de-guerre-russie-otan-en-ukraine/
ET
Allégation :
Les pertes de l’Ukraine et de la Russie selon le Mossad
Article originel :
İddia: MOSSAD’a göre Ukrayna ve Rusya kayıpları Hurseda.net, 25.01.23
Alors que la première année de la guerre Russie-Ukraine approche, les pertes de guerre prétendument annoncées par les services de renseignement israéliens révèlent les terribles dimensions de la guerre.
Selon les allégations du Mossad, les données de terrain du 14 janvier 2023 basées sur les renseignements israéliens sont énumérées comme suit :
RUSSIE :
418 000 soldats (plus 3 500 000 réservistes) et un nombre croissant de mercenaires Wagner :
23 avions
56 Hélicoptère
200 (S)UAV
889 Chars et véhicules blindés
427 Howitzer (systèmes d’artillerie)
12 Systèmes de défense aérienne
18 480 morts
44 500 personnes blessées
323 Captive
UKRAINE :
Avec 734 000 soldats (plus 100 000 réservistes) et des officiers, soldats et mercenaires de l’OTAN sur le terrain,
les pertes de l’Ukraine sont les suivantes :
302 avions
212 Hélicoptère
2,750 (S)UAV
6.320 Chars et véhicules blindés
7.360 Howitzer (systèmes d’artillerie)
497 Système de défense aérienne
157 000 morts
234 000 blessés
17.230 Captifs
234 morts – Entraîneurs militaires de l’OTAN (États-Unis et Royaume-Uni) 2.458 morts -Soldats de l’OTAN (Allemagne, Pologne, Lituanie, …)
5.360 morts – Mercenaires
(Agences) Facebook Twitter
Traduction automatique avec DeepL.com –
“Beaucoup d’entreprises se trouvent dans des situations où elles constatent que les salariés ne sont pas là, elles ne sont pas prévenues, ce qui a pour conséquence une désorganisation profonde”, avait avancé, lors de l’examen du texte de loi à l’Assemblée nationale, Philippe Vigier (MoDem), l’un des députés à l’origine de la mesure.
https://www.capital.fr/votre-carriere/abandon-de-poste-les-salaries-en-abusent-ils-vraiment-1461004
L’autopsie a révélé une inflammation à la fois dans le cerveau et dans le cœur.
Le patient a subi des lésions cérébrales aiguës sans rapport avec son diagnostic de maladie de Parkinson.
Il y avait des plaques de dégénérescence et d’inflammation à l’avant de son cerveau et son cerveau contenait en outre trois types de résultats pathologiques: la mort neuronale ( les cellules nerveuses mortes ), infiltration microgliale ( cellules de défense dans le cerveau ) et lymphocytes associés à une infection virale.
Ils ont trouvé des protéines de pointe dans le lobe frontal du cerveau, ainsi que dans d’autres sections du cerveau.
Mais il n’y avait pas de protéine nucléocapside présente.
Ils ont trouvé une myocardite – c’est-à-dire un gonflement — dans le cœur.
Il ressortait clairement de l’autopsie que la myocardite n’était pas causée par une infection naturelle mais plutôt par des protéines de pointe induites par le vaccin.
Cette recherche a montré très clairement que la pathologie du patient était causée par les vaccins et non par une infection naturelle.
Le rapport de cas comprenait des photographies détaillées des tissus affectés du patient. Les images parlent d’elles-mêmes: les scientifiques ou les médecins qui nient le lien entre les vaccins et les découvertes anormales des tissus n’ont qu’à revoir les images par eux-mêmes.
Des scientifiques allemands ont découvert que la vaccination contre l’ARNm, et non l’infection à COVID-19 elle-même, a causé des lésions cérébrales et cardiaques chez un adulte plus âgé souffrant de conditions sous-jacentes.
L’étude a été publié en octobre 2022 dans la revue Vaccines: “ A Case Report: Multifocal Necrotizing Encephalite and Myocarditis after BNT162b2 mRNA Vaccination against COVID-19. ” Il a examiné la situation d’un Allemand de 76 ans atteint de la maladie de Parkinson.
Le patient est décédé trois semaines après avoir reçu sa troisième injection de COVID-19.
Le premier vaccin qu’il a reçu en mai 2021 était le vaccin Oxford / AstraZeneca. Cela a été suivi de deux autres injections en juillet puis en décembre de la même année. Ses deux vaccins ultérieurs ont tous deux été fabriqués par Pfizer.
Après le deuxième vaccin, la famille du patient a remarqué des changements marqués dans son comportement. Il a commencé à ressentir plus d’anxiété, est devenu plus léthargique et ne voulait pas être touché. Il s’est retiré, même des membres de sa famille proche, et les symptômes de sa maladie de Parkinson préexistante se sont considérablement aggravés.
Compte tenu des symptômes cliniques ambigus avant sa mort, sa famille a demandé une autopsie.
Les résultats inhabituels et fascinants de l’autopsie ont conduit à un rapport de cas publié sur ce qui est maintenant revendiqué comme un décès induit par le vaccin.
Ce patient n’avait aucun antécédent d’infection à COVID-19. Cette histoire clinique a été confirmée par pathologie.
“ On peut dire définitivement que ces dommages ont été causés par le vaccin, ” a insisté l’infirmière éducatrice, John Campbell, Ph.D., qui a expliqué l’étude en détail en 14 minutes Vidéo YouTube qu’il a partagé avec son 2,68 millions d’abonnés le 16 février.
La pandémie de COVID-19 a été causée par un virus appelé SRAS-CoV-2, qui est l’abréviation de Coronavirus 2, un syndrome respiratoire aigu sévère. Il s’agit d’un virus à ARN appartenant à la famille des Coronaviridae. Le nom de cette famille de virus est dérivé du mot latin “ corona, ” signifiant couronne. En effet, le virus sous microscopie électronique apparaît comme une couronne en raison de petites projections de bulbes formées par des protéines virales à pointe ( S ).
Comme de nombreux autres virus respiratoires, les coronavirus se propagent rapidement à travers des gouttelettes qu’une personne projette hors de la bouche ou du nez lorsqu’elle respire, tousse, éternuements ou parle. Les gouttelettes peuvent ensuite être inhalées par une autre personne.
Une fois à l’intérieur du système respiratoire du receveur, la protéine virale de pointe joue un rôle clé dans la communication virus-cellule hôte. Une communication réussie fait en sorte que le virus est accepté par la cellule du receveur, achevant le processus d’infection naturelle.
Outre la protéine de pointe, le SRAS-CoV-2 possède également d’autres protéines structurelles essentielles, telles qu’une enveloppe ( E ), une membrane ( M ) et des protéines nucléocapsides ( N ).
La protéine de pointe étant la protéine virale la plus abondante et la plus exposée “ ”, c’était le choix évident comme antigène viral pour le développement du vaccin.
En fait, sans exception, tous les vaccins COVID-19 approuvés par la FDA utilisent la protéine de pointe comme antigène viral. Aucun des vaccins autorisés n’utilise d’autres protéines du SRAS-CoV-2 comme antigènes viraux.
En tant qu’ancien développeur de vaccins avec un doctorat. en génétique moléculaire, Joe Wang a remis en question la conception de ces vaccins. Dans le même temps, cependant, cette conception de vaccin permet de distinguer facilement la pathologie causée par l’infection par le virus par rapport à la pathologie causée par le vaccin.
“ Donc, si vous voyez des protéines de pointe par lui-même, cela signifie que c’est un vaccin; si vous voyez des protéines de pointe et des protéines nucléocapsides, cela signifie que c’est une infection virale naturelle. C’est la différence entre les deux, ” Campbell a expliqué.
Afin de procéder à une autopsie pour déterminer la cause du décès chez le patient atteint de la maladie de Parkinson, âgé de 76 ans, les chercheurs ont traité les tissus de son corps avec du formol, les ont coupés en sections, et les a colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine afin de les examiner.
Ils ont comparé leurs échantillons avec des témoins, les deux cellules cultivées des patients COVID-19 positifs au SRAS-CoV-2 ( qui contenaient à la fois la protéine de pointe et le nucléocapside ), et les cellules cultivées qui contenaient une expression de protéine de pointe induite par le vaccin mais pas de protéine nucléocapside.
L’autopsie a révélé une inflammation à la fois dans le cerveau et dans le cœur.
Le patient a subi des lésions cérébrales aiguës sans rapport avec son diagnostic de maladie de Parkinson. Il y avait des plaques de dégénérescence et d’inflammation à l’avant de son cerveau et son cerveau contenait en outre trois types de résultats pathologiques: la mort neuronale ( les cellules nerveuses mortes ), infiltration microgliale ( cellules de défense dans le cerveau ) et lymphocytes associés à une infection virale. Ils ont trouvé des protéines de pointe dans le lobe frontal du cerveau, ainsi que dans d’autres sections du cerveau. Mais il n’y avait pas de protéine nucléocapside présente.
Ils ont trouvé une myocardite – c’est-à-dire un gonflement — dans le cœur. Il ressortait clairement de l’autopsie que la myocardite n’était pas causée par une infection naturelle mais plutôt par des protéines de pointe induites par le vaccin.
Cette recherche a montré très clairement que la pathologie du patient était causée par les vaccins et non par une infection naturelle.
Le rapport de cas comprenait des photographies détaillées des tissus affectés du patient. Les images parlent d’elles-mêmes: les scientifiques ou les médecins qui nient le lien entre les vaccins et les découvertes anormales des tissus n’ont qu’à revoir les images par eux-mêmes.
Les pathologistes ont découvert que le patient avait plusieurs endroits dans son cerveau où il y avait des dommages, ainsi qu’un gonflement généralisé dans son cœur. Ils ont également confirmé qu’il souffrait de la maladie de Parkinson et qu’il avait un durcissement de longue date dans ses artères. Enfin, ils ont trouvé des signes de pneumonie, qui peuvent avoir été causés par son aspiration à sa propre salive ou à d’autres fluides corporels.
“ Il semble que ce qui s’est passé ici soit que les vaccins ont causé des lésions cérébrales, ” dit Campbell. Il semble que les lésions cérébrales induites par le vaccin aient provoqué des convulsions chez le patient.
Ensuite, les crises ( ce que Campbell a appelé “ ajuster ” ) l’ont fait perdre connaissance, et bien qu’inconscient, il a respiré certains de ses propres vomissements ou salive, qui a contribué à sa cause de décès.
“ Le vaccin circulant autour du corps entrera en contact avec les vaisseaux sanguins. Donc le lipo-nanoparticules contenant l’ARNm ira dans les vaisseaux sanguins. Et ce sont les vaisseaux sanguins ’ eux-mêmes qui exprimeront la protéine de pointe, ” Campbell a expliqué. Lorsque la protéine de pointe est exprimée dans le cerveau et le cœur, elle provoque une réponse inflammatoire et entraîne la mort de différentes parties du cerveau.
C’est une question que Campbell a posée dans sa vidéo — une pour laquelle il n’avait pas de réponse. Pourquoi les pathologistes allemands effectuent-ils des autopsies, mais pas les médecins américains et britanniques?
Dr. Robert Lowry, un neurologue basé au Texas qui se spécialise en médecine sportive, pense que ne pas effectuer d’autopsies est une grave erreur. Lowry, qui pratique la médecine depuis plus de 30 ans, a insisté en juillet 2022 pour que des autopsies doivent être effectuées sur chaque jeune qui meurt subitement et de façon inattendue.
De plus, sur la base de ses recherches et de ce qu’il a vu dans sa pratique clinique, Lowry n’hésite pas à dire que nous ne devrions plus faire d’injections d’ARNm.
“ Nous devons arrêter ces vaccins car ils ne fonctionnent pas, a déclaré Lowry à The Epoch Times.
“ Ils ne préviennent pas les maladies et le risque immédiat et à long terme de blessures graves est supérieur à celui de la maladie réelle. L’immunité naturelle contre les virus corona est bien meilleure et plus durable que tout ce que ces vaccins fournissent, ” a-t-il dit.
Les opinions exprimées dans cet article sont les opinions de l’auteur et ne reflètent pas nécessairement les vues de The Epoch Times. Epoch Health accueille la discussion professionnelle et le débat amical. Pour soumettre un article d’opinion, veuillez suivre ces directives et soumettre notre forme ici.
LA CHINE A UN PLAN
Après un an de neutralité ambigüe, le ministère chinois des affaires étrangères a pour la première fois publié un document détaillant la position de Pékin dans la guerre en Ukraine – le jour même où le Spiegel révélait que la Chine et la Russie pourraient être en train de négocier sur l’envoi de drones.
AUTEUR LE GRAND CONTINENT • IMAGE © AP PHOTO/DARKO VOJINOVIC
Source : La Chine a un plan – Le Grand Continent
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1. Respecter la souveraineté de tous les pays. Le droit international universellement reconnu, y compris les buts et principes de la Charte des Nations Unies, doit être strictement observé. La souveraineté, l’indépendance et l’intégrité territoriale de tous les pays doivent être effectivement défendues. Tous les pays, grands ou petits, forts ou faibles, riches ou pauvres, sont des membres égaux de la communauté internationale. Toutes les parties doivent conjointement faire respecter les normes fondamentales régissant les relations internationales et défendre l’équité et la justice internationales. L’application égale et uniforme du droit international doit être encouragée, tandis que les doubles standards doivent être rejetés.
Il est à noter ici que la souveraineté concerne en question est celle des « pays » — non des peuples et de leur droit à l’auto-détermination. Selon cette ligne, Pékin défend un « principe de souveraineté » qui lui permet dans le même temps d’affirmer sa politique « d’une seule Chine » vis-à-vis de Taïwan. À la Conférence de Munich la semaine dernière, le ministre des affaires étrangères chinois Wang Yi avait d’ailleurs eu l’occasion de le rappeler en réponse à une question de Wolfgang Ischinger qui lui demandait de rassurer la communauté internationale quant à l’éventualité d’une escalade militaire dans la région : « je vous rassure sur le fait que Taïwan fait bien partie de la Chine. »
2. Abandonner la mentalité de la guerre froide. La sécurité d’un pays ne doit pas être recherchée au détriment des autres. La sécurité d’une région ne doit pas être obtenue par le renforcement ou l’expansion de blocs militaires. Les intérêts et les préoccupations légitimes de tous les pays en matière de sécurité doivent être pris au sérieux et traités correctement. Il n’existe pas de solution simple à une question complexe. Toutes les parties devraient, en suivant la vision d’une sécurité commune, globale, coopérative et durable et en gardant à l’esprit la paix et la stabilité à long terme du monde, contribuer à forger une architecture de sécurité européenne équilibrée, efficace et durable. Toutes les parties devraient s’opposer à la recherche de leur propre sécurité au détriment de celle des autres, empêcher la confrontation entre blocs et œuvrer ensemble pour la paix et la stabilité sur le continent eurasien.
3. Cesser les hostilités. Le conflit et la guerre ne profitent à personne. Toutes les parties doivent rester rationnelles et faire preuve de retenue, éviter d’attiser les flammes et d’aggraver les tensions, et empêcher la crise de se détériorer davantage, voire d’échapper à tout contrôle. Toutes les parties doivent aider la Russie et l’Ukraine à travailler dans la même direction et à reprendre le dialogue direct le plus rapidement possible, afin de désamorcer progressivement la situation et de parvenir à un cessez-le-feu complet.
4. Reprendre les pourparlers de paix. Le dialogue et la négociation sont la seule solution viable à la crise ukrainienne. Tous les efforts en faveur d’un règlement pacifique de la crise doivent être encouragés et soutenus. La communauté internationale doit continuer à promouvoir les pourparlers de paix, aider les parties au conflit à s’acheminer vers un règlement politique dès que possible, et créer les conditions et les plateformes nécessaires à la reprise des négociations. La Chine continuera à jouer un rôle constructif à cet égard.
Après une phase initiale de discrétion et de prudence pendant les premiers mois du conflit, Pékin cherche désormais à se positionner de plus en plus comme une puissance de médiation. C’est dans cette mise en scène diplomatique que s’inscrit la publication de ce document, qui vient ponctuer une tournée internationale de Wang Yi.
5. Résoudre la crise humanitaire. Toutes les mesures susceptibles d’atténuer la crise humanitaire doivent être encouragées et soutenues. Les opérations humanitaires doivent respecter les principes de neutralité et d’impartialité, et les questions humanitaires ne doivent pas être politisées. La sécurité des civils doit être protégée efficacement et des couloirs humanitaires doivent être mis en place pour l’évacuation des civils des zones de conflit. Des efforts sont nécessaires pour accroître l’aide humanitaire dans les zones concernées, améliorer les conditions humanitaires et assurer un accès humanitaire rapide, sûr et sans entrave, afin d’éviter une crise humanitaire à plus grande échelle. Il convient d’aider les Nations unies à jouer un rôle de coordination dans l’acheminement de l’aide humanitaire vers les zones de conflit.
6. Protéger les civils et les prisonniers de guerre. Les parties au conflit doivent se conformer strictement au droit humanitaire international, éviter d’attaquer des civils ou des installations civiles, protéger les femmes, les enfants et les autres victimes du conflit, et respecter les droits fondamentaux des prisonniers de guerre. La Chine soutient l’échange de prisonniers de guerre entre la Russie et l’Ukraine et appelle toutes les parties à créer des conditions plus favorables à cette fin.
7. Assurer la sécurité des centrales nucléaires. La Chine s’oppose aux attaques armées contre les centrales nucléaires ou d’autres installations nucléaires pacifiques, et appelle toutes les parties à respecter le droit international, y compris la Convention sur la sûreté nucléaire (CSN), et à éviter résolument les accidents nucléaires d’origine humaine. La Chine soutient l’Agence internationale de l’énergie atomique (AIEA), qui joue un rôle constructif dans la promotion de la sûreté et de la sécurité des installations nucléaires pacifiques.
8. Réduire les risques stratégiques. Les armes nucléaires ne doivent pas être utilisées et les guerres nucléaires ne doivent pas être menées. La menace ou l’utilisation d’armes nucléaires doit être combattue. La prolifération nucléaire doit être empêchée et la crise nucléaire évitée. La Chine s’oppose à la recherche, au développement et à l’utilisation d’armes chimiques et biologiques par tout pays et en toutes circonstances.
9. Faciliter les exportations de céréales. Toutes les parties doivent mettre en œuvre l’Initiative céréalière de la mer Noire, signée par la Russie, la Turquie, l’Ukraine et les Nations unies, de manière complète et efficace et équilibrée, et aider les Nations unies à jouer un rôle important sur ce sujet. L’initiative de coopération sur la sécurité alimentaire mondiale proposée par la Chine offre une solution réalisable à la crise alimentaire mondiale.
10. Arrêter les sanctions unilatérales. Les sanctions unilatérales et les pressions ne peuvent pas résoudre la question ; elles ne font que créer de nouveaux problèmes. La Chine s’oppose aux sanctions unilatérales non autorisées par le Conseil de sécurité des Nations unies. Les pays concernés devraient cesser d’abuser des sanctions unilatérales et de la « juridiction au bras long » contre d’autres pays, afin de faire leur part dans la désescalade de la crise ukrainienne et de créer les conditions permettant aux pays en développement de développer leurs économies et d’améliorer la vie de leurs populations.
11. Maintenir la stabilité des chaînes industrielles et d’approvisionnement. Toutes les parties doivent sérieusement maintenir le système économique mondial existant et s’opposer à l’utilisation de l’économie mondiale comme outil ou arme employée à des fins politiques. Des efforts conjoints sont nécessaires pour atténuer les retombées de la crise et empêcher qu’elle ne compromette la reprise économique mondiale et ne perturbe la coopération internationale dans les domaines de l’énergie, de la finance, du commerce alimentaire et des transports.
12. Promouvoir la reconstruction d’après-guerre. La communauté internationale doit prendre des mesures pour soutenir la reconstruction d’après-guerre dans les zones de conflit. La Chine est prête à fournir une aide et à jouer un rôle constructif dans cette entreprise.
Car, toujours selon l’auteure, « ce sont les problèmes concrets qui déterminent la pensée philosophique. Les idées s’incarnent toujours dans un contexte précis. Par exemple, ce sont les défis ou les problèmes posés par le capitalisme qui finiront par donner naissance à la pensée socialiste. »
«La Nuit où Laurier Gaudreault s’est réveillé» : Xavier Dolan nous met KO
Dans «la Nuit où Laurier Gaudreault s’est réveillé», Xavier Dolan joue Elliott, le petit frère toxico qui sort de cure pour accompagner les derniers instants de sa mère. Fred Gervais
Le cinéaste canadien passe magistralement le cap du petit écran en livrant sa première série, à retrouver à partir de ce lundi sur Canal +.
Il nous en livre quelques clés d’entrée. Dans «la Nuit où Laurier Gaudreault s’est réveillé», Xavier Dolan joue Elliott, le petit frère toxico qui sort de cure pour accompagner les derniers instants de sa mère. Fred Gervais 2 Par Yves Jaeglé
Le 22 janvier 2023 à 11h06
Histoire de famille, histoire deux familles. Les Larouche et les Gaudreault, voisins unis à la vie à la mort, désunis par un drame, un mensonge ou un secret.
Source : «La Nuit où Laurier Gaudreault s’est réveillé» : Xavier Dolan nous met KO – Le Parisien
Pour aller dans le détail, les autorités canadiennes avaient déclaré 9225 décès en 2020.
Ensuite, en 2021, alors que les injections d’ARN messager ont commencé dès décembre 2020 et qu’on pouvait s’attendre à une diminution des décès étant donné les chiffres extraordinaires d’efficacité transmis par Big Pharma via les médias, le nombre de décès par le Covid-19 a même légèrement augmenté jusqu’à 9934 cas.
Puis, en 2022, alors que plus de 80 % de la population est doublement, voire triplement injecté, Santé Canada nous informe que 15 844 citoyens sont décédés du Covid-19 !
De plus, le pays constate une surmortalité importante qui est en corrélation directe avec l’augmentation des injections anti Covid-19 ! Il va bien falloir à un moment ou un autre demander des comptes à Justin Trudeau et son équipe, les seuls responsables de ce carnage, de ce massacre.
Pour toutes les entreprises participant à l’achat d’un bien culturel qualifié, une défiscalisation intervient.
La réduction d’impôt est égale à 90 % des versements effectués par l’entreprise, mais auquel le calcul fiscal doit prendre en compte une réduction limitée à 50 % du montant de l’impôt dû par l’entreprise pendant l’exercice au cours duquel le don a été effectué.
la société du luxe LVMH l’a racheté pour 43 millions d’euros lors d’une vente spéciale pour ensuite en faire un don à l’Etat.
Lundi 30 janvier, le tableau a fait ses débuts dans le musée parisien.
Source : Cadeau de LVMH, l’Etat reçoit un tableau à 43 M€ (voici la
L’homme le plus riche de la planète est français, patron de LVMH, et vient d’offrir un véritable trésor au musée d’Orsay. Dans quel but ?
Huile sur toile – 90 × 117 cm – Collection Musée d’Orsay, Paris © Gustave Caillebotte, Partie de bateau ou Canotier au chapeau haut de forme, vers 1877-1878
Le musée d’Orsay est, après le Louvre, le musée le plus populaire à Paris et en France. Dans sa collection, des oeuvres de Claude Monet, Pierre-Auguste Renoir, Edouard Manet, Paul Cézanne ou encore Camille Pissarro, qui ont le point commun d’avoir été soutenus par le collectionneur Gustave Caillebotte au XIXe siècle. À sa mort, une grande partie de sa collection fut installée au musée d’Orsay, formant ainsi le noyau de la collection d’oeuvres du mouvement impressionniste.
En parallèle à son quotidien de collectionneur, Gustave Caillebotte peignait également et parmi ses oeuvres devenues iconiques, La Partie de bateau, entre 1877 et 1878. Elle faisait partie des rares oeuvres de l’artiste à rester dans une collection privée. Ce n’est plus le cas aujourd’hui alors que la société du luxe LVMH l’a racheté pour 43 millions d’euros lors d’une vente spéciale pour ensuite en faire un don à l’Etat. Lundi 30 janvier, le tableau a fait ses débuts dans le musée parisien.
LVMH est aujourd’hui le chef de file mondial de l’industrie du luxe sur la base de son chiffre d’affaires. Il a fait de Bernard Arnault, son patron, l’homme le plus riche du monde avec une fortune estimée à plus de 162 milliards de dollars au 2 janvier 2023, loin devant Elon Musk (137 milliards de dollars). En offrant l’oeuvre de Gustave Caillebotte à l’Etat français, le groupe d’entreprise va pouvoir bénéficier d’avantages fiscaux.
En 2003, l’Etat publié la version initiale de l’avis d’appel au mécénat d’entreprise pour l’acquisition par l’Etat d’un trésor national dans le cadre de l’article 238 bis 0 A du code général des impôts :
Le ministre de la Culture et de la Communication informe les entreprises imposées à l’impôt sur les sociétés d’après leur bénéfice réel qu’elles peuvent bénéficier de la réduction d’impôt sur les sociétés prévue à l’article 238 bis 0 A du code général des impôts égale à 90 % des versements qu’elles pourraient effectuer en participant à l’acquisition par l’Etat pour un musée de France d’un trésor national.
En effet, depuis 2002, le mécénat d’entreprises pour le financement et le don de “trésors nationaux” s’accompagne d’avantages fiscaux. Une loi qui a permis à l’Etat de protéger les biens culturels présentant un intérêt majeur pour le patrimoine français. Pour toutes les entreprises participant à l’achat d’un bien culturel qualifié, une défiscalisation intervient. La réduction d’impôt est égale à 90 % des versements effectués par l’entreprise, mais auquel le calcul fiscal doit prendre en compte une réduction limitée à 50 % du montant de l’impôt dû par l’entreprise pendant l’exercice au cours duquel le don a été effectué.
Pour un musée français, il serait impossible d’acquérir une oeuvre à un montant aussi élevé. Seuls les musées américains ou du Moyen-Orient sont en mesure de débourser de telles sommes. Le musée d’Orsay possède un budget limité à 3 millions d’euros. Bien sûr, toutes les oeuvres classées trésor national ne coûtent pas aussi cher, mais le programme de défiscalisation en favorisant le mécénat permet à l’Etat de financer des oeuvres et protéger son patrimoine sans devoir débourser un seul euro lors de la vente.
Pour les visiteurs intéressés, il faudra se rendre dès ce mardi 31 janvier au musée au niveau du cinquième étage. La Partie de bateau de Gustave Caillebotte a pris place à la place d’un autre tableau de Renoir Bal du moulin de la Galette, qui a été légèrement déplacé sur un autre pan de la pièce d’exposition. L’oeuvre de Caillebotte, qui est la douzième du musée, sera exposée ici pendant le reste de l’année avant de préparer une tournée spéciale 150e anniversaire, dans laquelle La Partie de Bateau sera prêté dans plusieurs musées français.
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Le 24 février, date anniversaire de l’invasion de l’Ukraine, le ministère chinois des affaires étrangères a publié la « position de la Chine sur le règlement politique de la crise ukrainienne ». Ce document précise les grandes lignes d’un plan plus large qui avait été détaillé le 21 février dans l’initiative globale de sécurité et évoqué le 18 février lors d’un discours prononcé par le directeur du bureau central des Affaires étrangères chinois à la Conférence de Munich sur la sécurité. Wang Yi avait alors déclaré que « bien que la Chine ne soit pas directement concernée par le conflit, elle ne restait pas pour autant inactive ». C’est à cette occasion qu’il avait également annoncé que Pékin allait publier un document traduisant la position chinoise relative à la guerre. C’est celui-ci que nous traduisons.
Le jour même de sa parution, l’hebdomadaire Der Spiegel faisait des révélations selon lesquelles « la Chine serait en train de négocier avec la Russie pour lui fournir des drones kamikazes ». Cet article s’inscrit quant à lui dans une séquence ouverte dimanche 19 février lorsque, à la suite d’une rencontre avec Wang Yi en marge de la Conférence de Munich, Antony Blinken avait déclaré que Washington disposait d’informations selon lesquelles Pékin envisagerait de fournir des armes létales à Moscou.
Quelques jours après, le 23 février, des responsables américains ont fait savoir que l’administration Biden « envisageait de rendre publics » ces renseignements. Si le ministère chinois des Affaires étrangères a nié ces informations, accusant les États-Unis de « déplacer les responsabilités et de répandre de la désinformation », les informations du Spiegel vont le sens des craintes exprimées par Blinken — et même « encore plus loin ».
En tout état de cause, ce document chinois qui entend proposer une médiation fondée sur le principe de « souveraineté de tous les pays » a été accueilli de manière circonspecte par l’OTAN, dont le Secrétaire général Jens Stoltenberg a affirmé que « la Chine n’a pas beaucoup de crédibilité parce qu’elle n’a pas été en mesure de condamner l’invasion illégale de l’Ukraine » et par l’Union européenne – Josep Borrell considérant qu’il ne s’agissait pas d’un plan de paix. Le 24 février, lors d’une conférence de presse, le Président ukrainien Volodymyr Zelensky — qui a déjà détaillé ses conditions de la paix — a quant à lui considéré la démarche de Pékin comme « nécessaire », se montrant ouvert à une discussion avec la Chine, ouvrant une nouvelle phase : « j’ai l’intention de rencontrer Xi Jinping. »