1. Introduction

Les cellules ciliées auditives perdues ( HC ) chez les mammifères adultes ne peuvent pas être régénérées, entraînant une perte auditive permanente. À l’inverse, les HC perdus chez les oiseaux sont régénérés par la prolifération des cellules de soutien ( SCs ) et la nouvelle différenciation HC (Corwin et Cotanche, 1988; Ryals and Rubel, 1988), conduisant à la restauration de l’audition (Ryals et al., 2013). Une capacité de régénération limitée dans l’organe de Corti est également observée chez les mammifères nouveau-nés et est associée à un pool de cellules progénitrices dans l’épithélium sensoriel cochléaire (Atkinson et al., 2015; Zhang et al., 2020). Il s’agit notamment d’un sous-ensemble de SC à proximité des HC, tels que les cellules frontalières internes ( IBC ), les cellules du pilier interne ( IPC ), les cellules du déitre de troisième rangée ( DC ), et crête épithéliale supérieure latérale ( LGER ) (Chai et al., 2011; Shi et al., 2012; Kubota et al., 2021). Des études axées sur les voies de signalisation chez la souris qui entraînent la régénération de HC avant le début de l’audition suggèrent que HC peut se régénérer par division mitotique suivie d’une différenciation, via Activation du signal WNT (Chai et al., 2012; Shi et al., 2012, 2014). Alternativement, les HC peuvent se régénérer à partir des cellules progénitrices par voie directe trans-différenciation, en bloquant la signalisation NOTCH (Yamamoto et al., 2006; Korrapati et al., 2013; Mizutari et al., 2013; Bramhall et al., 2014). À mesure que la maturation progresse, les cellules cochléaires se limitent des deux mécanismes de régénération (Brown and Groves, 2020). Ces résultats ont été interprétés comme signifiant que même une capacité de régénération limitée est perdue à cause de la cochlée de mammifères adultes. Notamment, les progéniteurs des cellules de type HC peuvent provenir de cellules proliférantes dans les cultures sphériques du tissu utriculaire humain adulte, mais pas de tissus cochléaires adultes (Senn et al., 2020). Néanmoins, ces résultats n’excluent pas la possibilité que des progéniteurs cochléaires de mammifères adultes au repos existent (Hoa et al., 2020), mais nécessitent un microenvironnement différent pour manifester leur potentiel.

La restauration auditive chez les oiseaux a lieu quel que soit l’âge. Les premières études ont montré que la signalisation par la phosphoinositide 3-kinase ( Pi3K ) et la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique ( EGFR ) sont nécessaires pour la prolifération de l’oreille interne SC chez les souris de poulet et de néonatale (Witte et al., 2001; White et al., 2012). D’autres études sur la régénération aviaire ont impliqué l’activation du VEGF, qui signale également via PI3K (Matsunaga et al., 2020; Wan et al., 2020). Dans la famille EGFR, il existe quatre récepteurs tyrosine kinases étroitement liés: ERBB1, ERBB2, ERBB3 et ERBB4. Ceux-ci forment des homo ou des hétérodimers les uns avec les autres lors de la liaison du ligand et induisant des voies moléculaires SC prolifération, migration et survie. Nous avons précédemment montré que la signalisation médiée par ERBB2, qui est le partenaire d’hétérodimérisation préféré des trois autres membres de la famille EGFR, stimule la prolifération des SC dans les cultures explantes et la formation surnuméraire de type HC in vivo dans la cochlée de souris néonatale (Zhang et al., 2018). Notamment, dans ces études, le traçage de la lignée a révélé que les cellules exprimant une forme mutante ( CA ) constitutive d’ERBB2 ont induit ces activités dans les cellules voisines, suggérant la présence d’une cascade de signal amplificateur qui recrute des tissus adjacents. Conformément à cette interprétation, la protéine SOX2 a été largement régulée à la baisse dans le virage apical abritant des cellules CA-ERBB2 clairsemées + (Zhang et al., 2018).

Identifier les voies de signalisation médiées par ERBB2 associées aux changements de SC qui peuvent faciliter la régénération de HC, nous avons effectué un séquençage d’ARN monocellulaire ( scRNA-seq ) sur des SC néonatals triés avec et sans CA-ERBB2. Nous avons effectué une analyse génétique spécifique au cluster pour identifier les gènes exprimés différentiellement ( DEGs ) dans différentes populations cellulaires. Nos objectifs étaient d’identifier des grappes de cellules CA-ERBB2 qui sont transcriptionnellement distinctes, attribuer des clusters et des DEG aux sous-types SC et identifier les voies de signalisation secondaires candidates qui pourraient agir en aval de la signalisation ERBB2 pour promouvoir les changements locaux. Nous avons en outre cherché à confirmer si certains médiateurs en aval étaient également exprimés dans la cochlée de jeunes souris adultes après dommages et activation CA-ERBB2, et si oui, où ils étaient localisés.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Approbation éthique

Toutes les expériences utilisant des animaux ont été approuvées à l’avance par le Comité universitaire de recherche animale ( UCAR ) à l’Université de Rochester, numéro de protocole 2010-011, PI Patricia White, et par le Bureau d’examen des soins et utilisations des animaux ( ACURO ) du ministère de la Défense.

2.2. souris

Les souches de souris suivantes ont été utilisées. Fgfr3-iCre (Cox et al., 2012) était un cadeau aimable du Dr. Jian Zuo. TetON-CA-ErbB2 (Xie et al., 1999) et CBA / CaJ, ont été achetés aux Laboratoires Jackson. ROSA-floxed-rtTA / GFP (Belteki et al., 2005) était un cadeau aimable du Dr. Lin Gan. Les souris TetON-CA-ErbB2 hébergent un ErbB2 transgène codant pour une protéine CA ERBB2 ( CA-ERBB2 ), qui ne nécessite pas de liaison ligand ou d’hétérodimérisation avec d’autres partenaires ERBB pour la signalisation active. Les souris Fgfr3-iCre et TetON-CA-ERBB2 étaient des croisements pour générer des souris transgéniques hétérozygotes doubles qui ont ensuite été utilisées comme éleveurs. Dans une deuxième reproduction, des hétérozygotes doubles ont été croisés avec des souris homozygotes ROSA-floxed-rtTA / GFP.

2.3. Génotypage

Pour les expériences scRNA-seq et la validation des données par RT-qPCR, les chiots générés ont été génotypés à P0 pour identifier les souris triple transgéniques qui hébergent Fgfr3-iCre, ROSA-floxed-rtTA / Gfp, et TetON-CA-ErbB2 ( nommé ici CA-ERBB2 ). Les chiots n’étaient pas génotypés pour identifier le sexe. Les oligonucléotides utilisés dans le génotypage sont fournis dans Tableau supplémentaire 2. Littermates avec les deux Fgfr3-iCre et ROSA-floxed-rtTA / Gfp ont été utilisés comme contrôles.

2.4. Exposition au bruit

Pour la validation des données scRNA-seq chez les jeunes adultes exposés au bruit, les souris mâles et femelles ont été utilisées de manière égale. Des souris abritant le Fgfr3-iCre et CA-Erbb2 les transgènes ont été rétrocroisés à CBA / CaJ pendant au moins quatre générations, tandis que la ligne ROSA-rtTA-GFP est congénique sur C57BL6 / J. Ainsi, les souris expérimentales sont des souris hybrides CBA / C57, dont les caractéristiques de dommages sonores sont similaires à une réponse pure CBA / CaJ (Milon et al., 2018). Les souris de trois semaines ont été génotypées et sevrées. Des injections de tamoxifène ( 75 mg / kg ) ont été effectuées à P21, P22 et P23. À P28, leur audition a été testée par une réponse auditive du tronc cérébral ( ABR ) et des émissions acoustiques des produits de distorsion ( DPOAE ) (Zhang et al., 2021). Les souris ont ensuite été divisées en conditions d’exposition et de contrôle DOX. Les souris ont connu une exposition au bruit de 110 dB de 8 – 16 kHz de bruit de bande d’octave pendant 2 h, comme décrit précédemment (Zhang et al., 2021). Le lendemain ( 1 DPN ), des souris ont reçu des tests auditifs pour confirmer une perte auditive sévère induite par le bruit évidente par décalage de seuil pendant au moins 25 dB sur cinq fréquences ( 8, 12, 16, 24 et 32 kHz ). Deux jours plus tard ( 3 DPN ), le groupe DOX a reçu une injection de DOX ( 100 mg / kg ), suivie 30 min plus tard d’une injection de furosémide ( 400 mg / kg ) (Walters et Zuo, 2015). Le groupe témoin a reçu une injection saline, suivie de furosémide. Deux jours après ces injections ( 5 DPN ), les souris ont été euthanasiées et leurs cochlées fixées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4. Une deuxième cohorte de souris a été traitée de manière identique, sauf qu’elles ont également reçu 2 injections de 10 mg / kg 5-éthyl-2′-désoxyuridine ( EdU ) du kit d’imagerie Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogène, Carlsbad, CA, USA ), le lendemain de l’injection de DOX ( 4 DPN ) espacés de 8 h. Ces souris ont été euthanasiées sur 7 DPN et leurs cochléaires ont été fixées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4.

2.5. Dissociation cellulaire et tri FACS

L’activité iCRE a été induite par des injections de tamoxifène ( 75 mg / kg ) au P0 / P1 pour étiqueter les SC avec GFP et rtTA. Des injections de doxycycline ( 100 mg / kg ) ont été effectuées à P2 pour entraîner l’expression CA-ERBB2 dans les SC GFP +. La cochlée des chiots P3 a été collectée et incubée avec 1 ml d’Accutase^®solution ( Technologies cellulaires innovantes ) pendant 15 min à 37 ° C. Pour assurer une digestion reproductible, 2 – 4 cochlée ont été traités par tube. La solution Accutase a été retirée et la cochlée était des lavages doux dans du tampon HBSS libre de Ca2 +, Mg2 +. Les organes de chaque tube ont été dissociés par trituration pendant 2 – 3 min. Les cellules ont ensuite été filtrées avec une crépine cellulaire de 40 μm ( BD Biosciences ) et maintenues sur la glace jusqu’au tri. Pour l’exclusion des cellules mortes et des débris des échantillons pendant le tri, une suspension monocellulaire a été colorée avec du DAPI. Le tri a été effectué à 4 ° C dans un trieur de cellules FACSAria II ( BD Biosciences ) à l’aide d’une buse de 130 μm. La discrimination par dispersion a été utilisée pour éliminer les doublets et les échantillons ont été sélectionnés négativement avec le DAPI pour éliminer les cellules mortes et les débris. Pour scRNA-seq, des cellules GFP + simples ont été capturées dans une plaque à 96 puits avec 11.Tampon de lyse de 5 μl et inhibiteur de RNase sans le CDS IIA Oligo ( Takara Bio, Mountain View, CA, USA ), et stocké à − 80 ° C jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour la construction de bibliothèques d’ADNc. En moyenne, six chiots par génotype ont été traités pour trier des cellules GFP + simples en une seule plaque à 96 puits. Pour la validation des données par RT-qPCR, les cellules GFP + ont été capturées dans un seul tube avec un tampon de lyse de 100 μl contenant de la protéinase K et de la DNase ( Biodrome ). Les cellules triées ont ensuite été incubées pendant 10 min. à température ambiante, suivie de 5 min. à 37 ° C, et 5 min. à 75 ° C. Les échantillons ont été stockés à − 80 ° C jusqu’à l’analyse RT-qPCR.Pour la validation des données par RT-qPCR, les cellules GFP + ont été capturées dans un seul tube avec un tampon de lyse de 100 μl contenant de la protéinase K et de la DNase ( Biodrome ). Les cellules triées ont ensuite été incubées pendant 10 min. à température ambiante, suivie de 5 min. à 37 ° C, et 5 min. à 75 ° C. Les échantillons ont été stockés à − 80 ° C jusqu’à l’analyse RT-qPCR.Pour la validation des données par RT-qPCR, les cellules GFP + ont été capturées dans un seul tube avec un tampon de lyse de 100 μl contenant de la protéinase K et de la DNase ( Biodrome ). Les cellules triées ont ensuite été incubées pendant 10 min. à température ambiante, suivie de 5 min. à 37 ° C, et 5 min. à 75 ° C. Les échantillons ont été stockés à − 80 ° C jusqu’à l’analyse RT-qPCR.

2.6. Construction de bibliothèques RNA-seq unicellulaires

Les bibliothèques RNA-seq monocellulaires ont été construites selon le protocole SMART-Seq Single PLUS ( Takara Bio, Mountain View, CA, USA ). Des plaques congelées ont été décongelées sur de la glace. Ensuite, l’ADNc a été généré avec l’ajout des réactifs 3 ′ SMART-Seq CDS Primer II A et SMARTScribe II RT. l’ADNc a été amplifié via20 cycles de PCR, purifiés et évalués pour la quantité et la qualité par le test d’ADNdQubit ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ) et Fragment Analyzer ( Agilent, Santa Clara, CA, Analyse USA ), respectivement. Pour chaque puits, l’ADNc amplifié de 1 ng a été fragmenté et préparé pour la construction de la bibliothèque avec l’ajout d’adaptateurs de boucle de tige. L’amplification et l’indexation finales de la bibliothèque ont été effectuées sur 16 cycles d’amplification PCR. Après la purification des billes, les profils de bibliothèque individuels ont été évalués par Fragment Analyzer et quantifiés par le test dsDNA de Qubit. Les bibliothèques ont été diluées, regroupées en quantités équimolaires et séquencées sur une cellule de flux NovaSeq S1 ( Illumina, San Diego, CA, USA ) pour générer en moyenne 10 millions de lectures par cellule.

2.7. Prétraitement, regroupement et visualisation des données

Les lectures brutes générées à partir des plinthes Illumina ont été démultiplexées à l’aide de la version 2.19.1 de bcl2fastq. Le filtrage de qualité et la suppression de l’adaptateur sont effectués à l’aide de la version FastP 0.20.1 avec les paramètres suivants: “ – length_quality 13 – cut_front_tail_tail_1size Les lectures traitées / nettoyées ont ensuite été mappées au Mus musculusgénome de référence ( GRCm38 + Gencode-M25 Annotation ) en utilisant STAR_2.7.6a avec les paramètres suivants: “ — twopass Mode Basic – runMode aligneReads – outSAMtype BAM TriedByCoordinate — La quantification de la lecture au niveau du gène a été dérivée à l’aide du package subread-2.0.1 ( featureCounts ) avec un fichier d’annotation GTF ( Gencode M25 ) et les paramètres suivants: “ -s 2 -t exon -g gene_name. ” Les données générées par le séquençage ont été utilisées pour créer un objet Seurat à l’aide du package Seurat dans R ( v4.0.5 et v4.1.2 ). Les mesures de contrôle de la qualité ont été effectuées à l’aide des protocoles standard Seurat ( v4.0.4 et v4.1.0 ) et comprenaient l’identification de gènes uniques ( “ caractéristiques ” ) par cellule, le nombre total de molécules détectées ( “, et le pourcentage de contamination du génome mitochondrial.Les données ont été normalisées. Les clusters ont été identifiés avec la méthode Louvain, en utilisant PCA et UMAP pour réduire la dimensionnalité et tracer les cellules. Le clustering a été effectué en utilisant une réduction de dimensionnalité de 1:30 et deux résolutions distinctes, 0.2 et 0.6, dans la construction du graphique du plus proche voisin et la génération UMAP. En plus d’effectuer le filtrage et le regroupement des échantillons, Seurat a manipulé l’expression différentielle pour déterminer les gènes régulés à la hausse au sein des grappes et entre les groupes de condition. enrichR ( v3.0 ) a été utilisé pour effectuer un enrichissement de l’ensemble génétique sur les DEG (dans la construction du graphique du plus proche voisin et la génération UMAP. En plus d’effectuer le filtrage et le regroupement des échantillons, Seurat a manipulé l’expression différentielle pour déterminer les gènes régulés à la hausse au sein des grappes et entre les groupes de condition. enrichR ( v3.0 ) a été utilisé pour effectuer un enrichissement de l’ensemble génétique sur les DEG (dans la construction du graphique du plus proche voisin et la génération UMAP. En plus d’effectuer le filtrage et le regroupement des échantillons, Seurat a manipulé l’expression différentielle pour déterminer les gènes régulés à la hausse au sein des grappes et entre les groupes de condition. enrichR ( v3.0 ) a été utilisé pour effectuer un enrichissement de l’ensemble génétique sur les DEG (Xie et al., 2021). Un rapport final a été rendu à l’aide de RStudio et rmarkdown ( v2.10 ). L’identité des gènes a été analysée dans la ressource Gène Ontologie ( GO )¹ (Xie et al., 2021). L’analyse du processus biologique GO a été réalisée pour les gènes exprimés identifiés dans chaque cluster. Puisqu’il y avait de nombreux gènes exprimés pour certains des clusters, nous avons limité le nombre de marqueurs provenant de clusters spécifiques basés sur le changement de log-fold. Le seuil de changement de log-fold pour le cluster S7 était de 4, pour le cluster S0 était de 4 et pour le cluster S5 était de 6. Le seuil de changement de log-fold pour les clusters restants est resté à 2. Les modules du réseau d’interaction protéique ont été visualisés à l’aide de l’analyse en ligne du réseau STRING² (Szklarczyk et al., 2021).

2.8. Analyse RT-qPCR

Les lysats cellulaires préparés après le tri des cellules GFP + en tube unique ont été utilisés dans l’analyse RT-qPCR à l’aide de réactifs RT-qPCR en deux étapes SingleShot ( Biodrome-Rad ) conformément aux instructions de fabrication. Chaque réaction qPCR a été effectuée sur des cellules lysées correspondant à 10 cellules. Trois répétitions techniques ont été utilisées pour chaque gène analysé. Des puits avec des amorces mais sans échantillon d’ADNc ont été utilisés pour les témoins négatifs, tandis que les lysats cellulaires non traités avec la transcriptase inverse ont été utilisés comme contrôle de la contamination par l’ADN génomique. Les réactions qPCR ont été effectuées à l’aide du vélo thermique CFX Bio-Rad et le seuil de cycles ( Ct ) a été calculé avec le logiciel Bio-Rad CFX Manager. La méthode ΔΔCt a été utilisée pour calculer l’expression relative du gène. Eef1a1 et Tubb4a ont été précédemment testés et indiqués comme des gènes d’entretien ménager exprimant stables adéquats pour la normalisation (Park et al., 2016), et ont été utilisés ici comme gènes de référence pour calculer les différences d’expression des gènes entre les cellules Control et CA-ERBB2. Les valeurs Ct des répétitions techniques ont été moyennées et l’expression du gène dans l’échantillon CA-ERBB2 et l’échantillon de contrôle a été normalisée au niveau d’expression du gène de référence ( “ REF ” ) dans le même échantillon à déterminer ΔCt [ Ct _{( gène )}— Ct _{( REF )}]. Pour chaque gène, l’analyse de l’expression relative du gène a été effectuée à partir d’au moins trois échantillons biologiques ( trois triages FACS indépendants ). Le ΔCt pour chaque répétition biologique a été exponentiellement transformé en expression ΔCt ( 2^{– ΔCt}) avant la moyenne et la détermination de l’écart type ( SD ). La moyenne a ensuite été normalisée à l’expression du gène dans l’échantillon de contrôle pour trouver l’expression ΔΔCt dans l’échantillon CA-ERBB2. Les oligonucléotides utilisés dans la RT-qPCR sont fournis dans Tableau supplémentaire 2.

2.9. Immunochimie

Les cochlées fixes ont été décalcifiées dans 100 mM EDTA dans une solution saline à 4 ° C pendant 3 jours. Pour le cryoséctionnement, les tissus ont été immergés dans 30% de saccharose dans du PBS pendant la nuit, incorporés dans des PTOM, congelés dans de l’azote liquide et cryoséctionnés à 20 microns. Les sections ont été montées sur du verre coulissant et maintenues à − 30 ° C jusqu’à utilisation. L’immunostat des sections cochléaires de cryostat a été effectué pour examiner l’expression de gènes sélectionnés. Les sections ont été perméabilisées et bloquées dans du PBS avec 0,5% de sérum d’âne Triton X-100 et 5% ( tampon TDB ) pendant 1 h à 4 ° C, suivi d’une incubation avec des anticorps primaires dans TDB à 4 ° C pendant la nuit. Les sections ont été rincées brièvement quatre fois dans du PBS, puis incubées avec des anticorps secondaires dans du TDB à 4 ° C pendant la nuit. Les sections ont été rincées brièvement 4 fois en PBS. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés: anti-GFP de poulet ( 1: 100; Abcam; AB_300798 ),souris anti-PVALB ( 1: 1 000, EMD Millipore; MAB1572 ), chèvre anti-OPN ( SPP1; 1: 100; Systèmes de R&D; AF808 ), chèvre anti-TIMP1 ( 1: 09, lapin anti-CD44 ( 1: 100; Abcam; AB157107 ), lapin anti-pERBB2 ( 1: 200; Santa Cruz; sc-12352 ), chèvre anti-SOX2 ( 1: 500; Santa Cruz; sc-1, lapin anti-MYO7 ( 1: 1 000; Proteus; 25-6790 ), lapin anti-activé CASP3 ( 1: 500; Systèmes de R&D, AF835 ) et lapin anti-TAK1 ( 1: 500; Thermo Fisher Scientific; 28. Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.Systèmes D; AF980 ), lapin anti-CD44 ( 1: 100; Abcam; AB157107 ), lapin anti-pERBB2 ( 1: 200; Santa Cruz; sc-12352 ), chèvre anti-SOX2 ( 1: 5000; sc-17320 ), lapin anti-MYO7 ( 1: 1 000; Proteus; 25-6790 ), lapin anti-activé CASP3 ( 1: 500; R&D Systems, AF835 ) et lapin anti-TAG1: 5; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.Systèmes D; AF980 ), lapin anti-CD44 ( 1: 100; Abcam; AB157107 ), lapin anti-pERBB2 ( 1: 200; Santa Cruz; sc-12352 ), chèvre anti-SOX2 ( 1: 5000; sc-17320 ), lapin anti-MYO7 ( 1: 1 000; Proteus; 25-6790 ), lapin anti-activé CASP3 ( 1: 500; R&D Systems, AF835 ) et lapin anti-TAG1: 5; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.et lapin anti-TAK1 ( 1: 500; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.et lapin anti-TAK1 ( 1: 500; Thermo Fisher Scientific; 28H25L68 ). Des anticorps secondaires ont été achetés auprès de Jackson Immunoresearch. EdU a été révélé à l’aide du kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ( Invitrogen; C10340 ) en suivant les instructions du fabricant. L’imagerie a été réalisée à l’aide du microscope confocal Olympus FV1000.

3. Résultats

3.1. Conception expérimentale pour déterminer la transcription des SC cochléaires exprimant ERBB2

Pour effectuer une analyse scRNA-seq des SC exprimant ERBB2, nous avons utilisé le même modèle génétique de souris qui a révélé un effet indirect de l’activation d’ERBB2 sur l’expression SOX2 et la formation de cellules de type HC ectopique (Figure supplémentaire 1; Zhang et al., 2018). Ces souris abritent un inductible muté ErbB2 codage transgène CA-ERBB2. Afin de limiter l’activation de CA-ERBB2 aux SC, nous avons utilisé une ADN Cre recombinase inductible sous le contrôle du promoteur du gène SC Fgfr3 (Figure supplémentaire 2; Cox et al., 2012). Double souris hétérozygotes ( “ Tet-On ” CA-ErbB2, Fgfr3-iCre) a ensuite été élevé sur une ligne homozygote abritant un facteur de transcription TA “ floxed ”, avec un IRES-GFP à utiliser comme marqueur de lignée ( “ROSA-rtTA-Gfp” ). Les chiots résultants avec CA-ErbB2 et Fgfr3-iCre ( désigné ici comme “ CA-ERBB2 ” ) ont été utilisés pour analyser le transcriptome des SC avec signalisation ERBB2 induite; tandis que les chiots hébergeant Fgfr3-iCre ont été utilisés comme “ Contrôle. ” L’activation d’iCRE a été effectuée par deux injections de tamoxifène à P0 et P1, ce qui a entraîné l’expression de GFP pour étiqueter les SC (Figure supplémentaire 1). L’expression CA-ERBB2 a été induite à P2 par injection de doxycycline. Les organes de Corti ont été disséqués des chiots P3 et les GFP vivants + SC ont été purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence ( FACS ) en excluant les cellules qui avaient absorbé un colorant imperméable aux cellules (Figure supplémentaire 2). En moyenne, nous avons obtenu 55 ± 13 cellules GFP + par cochlée. Les bibliothèques d’ADNc d’ARN ont été préparées et séquencées à partir d’environ 300 GFP + cellules uniques par génotype collectées dans trois expériences FACS indépendantes avec 85% de cellules ayant moins de 20% d’expression de transcription mitochondriale (Figure supplémentaire 3).

3.2. De nouvelles populations de cellules cochléaires transcriptionnellement distinctes surviennent en réponse à la signalisation ERBB2

Les mesures de contrôle de la qualité ont révélé un nombre similaire de transcriptions et de dénombrements d’IMU pour les deux génotypes (Figure 1A). Un tracé UMAP préliminaire de toutes les cellules a révélé un mélange de CA-ERBB2 et de cellules de contrôle ainsi que des preuves de leur différenciation séparée (Figure 1A, à droite ). Un regroupement impartial ( résolution de regroupement de 0,2 ) a ensuite été utilisé pour regrouper toutes les cellules GFP + avant l’évaluation des changements de transcriptome associés à l’expression CA-ERBB2. Sur la base du modèle d’expression génique, les cellules GFP + purifiées FACS peuvent être regroupées en au moins 5 grappes (Figures 1B, C). Deux grappes ont montré des différences significatives entre les échantillons de contrôle et CA-ERBB2 dans la distribution des cellules cochléaires: le cluster C4, composé principalement de cellules de contrôle, et le cluster C3 entièrement formé par des cellules CA-ERBB2. Des changements importants dans la distribution cellulaire ont également été observés au sein du cluster C2, où les cellules CA-ERBB2 se sont clairement séparées des cellules de contrôle. Il n’y avait aucune différence entre Control et CA-ERBB2 dans la distribution des cellules cochléaires dans les grappes C0 et C1. Ces résultats suggèrent une hétérogénéité dans les réponses des SC à l’activation intrinsèque d’ERBB2. Dans une minorité de cellules GFP +, l’activation ERBB2 a entraîné une réponse transcriptionnelle plus importante, qui différenciait les cellules activées de la population parentale.

Pour mieux comprendre la diversité transcriptionnelle du SC cochléaire avec signalisation ERBB2 induite, nous avons effectué une résolution de regroupement impartiale ( de 0,6 ) qui a abouti à la distinction des sous-populations au sein des grappes C0, C1 et C2. Dix clusters uniques ( S0 – S9 ) ont été générés avec deux clusters composés de cellules CA-ERBB2 uniquement (Figure 1C). En particulier, en plus du cluster S4 qui correspond à C3 dans le premier clustering impartial, les cellules CA-ERBB2 du cluster C2 ont été distinguées en cluster S7. La plupart des cellules restantes du cluster C2 étaient des cellules de contrôle ( ∼ 80% ) et ont été identifiées comme cluster S2. Un autre cluster représenté principalement par des cellules de contrôle ( ∼ 90% ) est S5, ce qui correspond à C4 lors du premier clustering impartial. Dans les grappes restantes, la distribution des cellules cochléaires Control et CA-ERBB2 était similaire.

3.3. Attribution de sous-types SC aux clusters

Pour évaluer quels SC ont contribué à quels clusters, nous avons gravé l’expression de gènes spécifiques aux sous-types SC, comme décrit pour scRNA-seq de P1 SC (Kolla et al., 2020; Tableau supplémentaire 1 et Figure supplémentaire 4). À la naissance, Fgfr3-iCre peut être exprimé en cellules DC, internes et externes des piliers ( IPC, OPC ), cellules externes des cheveux ( OHC ) et cellules Hensen ( HeC ). Dans notre système, Fgfr3-iCre l’expression est plus clairsemée et l’expression dans HC, DC et HeC est biaisée vers la région apicale, où les cellules sont moins différenciées (Figure supplémentaire 2). Ici, nous avons utilisé l’analyse à 5 clusters, car nous anticipions un nombre similaire de types de cellules. Résultats en Figure 2 montrer que les marqueurs HC Ccer2, Pvalb, et Insm1 sont regroupés dans un sous-ensemble de C2 (Figures 2B, C). Le marqueur HeC Fst est exprimé en C1, alors que Nupr1 est présent en C1 et C2 (Figures 2B, D). Les cinq marqueurs DC, Hes5, Pdzk1ip1, S100a1, Prss23, et Lfng, ont été les plus fortement régulés en C2 (Figures 2B, E). Les fabricants de PC étaient plus ambigus, mais étaient également les plus réglementés en C2 (Figures 2B, F). C4, qui est composé principalement de cellules de contrôle, a exprimé tous les marqueurs examinés à un niveau modéré et n’a donc pas pu être identifié. C0 est un mélange de CA-ERBB2 et de cellules de contrôle, et il exprime une poignée de marqueurs spécifiques au sensoriel, qui étaient S100a1, S100b, et Cryab. Son identité est également ambiguë. C3 est composé exclusivement de cellules CA-ERBB2 et exprime principalement des marqueurs OPC (Figures 2B, F, note Smagp niveaux ). Cependant, il contient également des marqueurs d’identification pour LGER1 ( LGER groupe 1 ), tels que Dcn, Ddost, Pdia6, Rcn3, et Sdf2l1. Ceux-ci sont également enrichis en C1 et C2 (Figure 2G).

3.4. Une minorité de SC CA-ERBB2 sont transcriptionnellement distinctes des SC de contrôle

L’induction de la signalisation ERBB2 dans les cellules CA-ERBB2 peut entraîner l’activation de gènes qui ne sont normalement pas exprimés dans les SC cochléaires. Par conséquent, pour identifier les DEG entre les échantillons de contrôle et CA-ERBB2, nous avons effectué une analyse statistique en utilisant à la fois le test de somme de Wilcoxon et le test de vraisemblance-ratio ( LR ). Dans le test de somme de base de Wilcoxon, les DEG sont identifiés parmi les gènes qui ont un certain niveau d’expression dans les conditions comparées. Le test LR a permis la détection de DEG avec une expression indétectable dans une condition (McDavid et al., 2013). Les gènes ont été cartographiés dans la ressource GO (Figure 3A). Les séquences qui n’ont pas pu être cartographiées dans un enregistrement protéique correspondant dans le système de classification PANTHER ont été désignées “ ID non cartographiés. ” Ils représentent principalement des ARN et des pseudogènes non codants.

Utilisation du test de somme de rang Wilcoxon ( adj p < 0,05, logFC > 2 ), 584 DEG ont été identifiés, avec 68 gènes régulés à la hausse et 516 gènes régulés à la baisse (Tableau supplémentaire 3). Environ la moitié des gènes de chaque groupe étaient des ID non cartographiés. Près de 90% des DEG ont été trouvés dans moins de 10% de la population CA-ERBB2. Utilisation du test LR ( adj p < 0,05, logFC > 2 ), 1 556 DEG ont été identifiés (Tableau supplémentaire 4). Au total, 1 049 gènes ont été régulés à la hausse et 507 gènes ont été régulés à la baisse, et environ la moitié d’entre eux étaient des gènes codant pour les protéines (Figure 3A). Environ 64% des DEG ont été trouvés dans moins de 10% de la population de CA-ERBB2. Des parcelles de volcan ont été utilisées pour montrer les DEG pour les deux analyses (Figure 3B). Notez comment l’analyse LR permet d’identifier des DEG très importants comme Wnt10a (Figure 3B à droite ).

Dans les deux analyses, Spp1 figurait parmi les gènes les plus exprimés ( 132 fois changeant ) dans environ 80% des cellules CA-ERBB2, par rapport à l’expression de Spp1 dans 55,4% des cellules de contrôle. Spp1 sera décrit plus en détail plus loin. Lama3 figurait parmi les gènes les plus régulés à la baisse dans les cellules CA-ERBB2 dans les deux tests. Il a été détecté dans 3,4% des cellules CA-ERBB2, contre 23,2% des cellules de contrôle. LAMA3 est une sous-unité de laminines, qui assurent la médiation de la fixation, de la migration et de l’organisation des cellules en interagissant avec les récepteurs de l’intégrine et d’autres composants de la matrice extracellulaire ( ECM ) (Belkin et Stepp, 2000; Hamill et al., 2010). Dans le test LR, Kyphoscoliose peptidase (KyLe gène ) est le plus haut différentiellement exprimé ( 3530 fois ), mais seulement dans environ 7,3% des cellules CA-ERBB2, contre 21,5% des cellules témoins. La fonction proposée par KY est le maintien du cytosquelette et de la jonction neuromusculaire (Hedberg-Oldfors et al., 2016). Ces données suggèrent que certaines cellules CA-ERBB2 modifient l’environnement local, ce qui pourrait affecter le comportement des cellules voisines.

Pour mieux comprendre l’hétérogénéité transcriptionnelle des cellules CA-ERBB2 dans les grappes S4 et S7, nous avons identifié des gènes régulés vers le haut dans chaque grappe décrit dans Figure 1C, puis examiné les voies activées par rapport à la base de données des processus biologiques GO. Pour chacun des 10 clusters, nous avons analysé l’expression des gènes par rapport aux clusters restants. Utilisation des critères d’un ajusté p-valeur de < 0,05 et différence de niveaux d’expression supérieure à deux fois, nous avons trouvé 90 gènes exprimés dans le cluster S4 et 1102 gènes dans le cluster S7. L’expression de trente gènes supérieurs exprimés identifiés dans les grappes S4 et S7 par rapport à d’autres grappes est indiquée dans Figure 3C. Pour les grappes restantes, qui sont composées de cellules de contrôle et CA-ERBB2 ( à l’exception du cluster S5 ), nous avons constaté que S0 avait 1125 gènes exprimés, S1 – 810, S2 – 731, S3 – 359, S5 – 3722, S6 – 484, S8 – 426 et S9 – 144 (Tableau supplémentaire 5). Les 10 principaux gènes exprimés dans chaque cluster ont ensuite été utilisés pour générer des thermopuets (Figure supplémentaire 5).

L’analyse a révélé que parmi les gènes les plus exprimés dans le cluster S4, il y a les DEG identifiés dans le test de somme de Wilcoxon (Spp1, CD63, Tmsb4x; Figure 3B et Tableau supplémentaire 3), et dans le test LR (Spp1, Timp1, Dmp1, Mmp9, CD63; Figure 3B et Tableau supplémentaire 4). Selon la carte thermique, S4 n’était lié à aucun autre cluster (Figure supplémentaire 5). En revanche, le cluster S7, composé uniquement de cellules CA-ERBB2, avait certains gènes régulés vers le haut en commun avec des gènes régulés vers le haut dans le cluster S2, qui était principalement des cellules de contrôle. Cela suggère que les cellules CA-ERBB2 du cluster S7 proviennent de la même population que les cellules de contrôle du cluster S2. Parmi les gènes de S7 les plus exprimés, il y a les DEG identifiés dans le test LR (Plet1os, Rufy4, Plet1, Cutal) (Figure 3B et Tableau supplémentaire 4).

En ce qui concerne les grappes composées à la fois de CA-ERBB2 et de cellules de contrôle, certaines relations transcriptionnelles étaient également évidentes (Figure supplémentaire 5). Par exemple, le cluster S6 présentait des similitudes avec le cluster S1, qui se trouve à proximité sur l’analyse UMAP. Aucun gène marqueur n’a été exprimé dans les grappes S0, S3 et S5. Étonnamment, dans le groupe S5 composé principalement de cellules de contrôle, un certain niveau de régulation ascendante a été observé pour la plupart des gènes exprimés identifiés dans d’autres groupes, à l’exception des gènes du cluster S8. Enfin, les grappes S8 et S9 sont représentées par un petit nombre de cellules avec des gènes exprimés en amont généralement introuvables dans d’autres grappes, ce qui indique qu’il s’agit de populations transcriptionnellement distinctes. Cette analyse souligne la diversité des réponses des CS à l’expression CA-ERBB2.

En résumé, CA-ERBB2 a entraîné les plus grands changements transcriptionnels dans une minorité de cellules, présumées être des DC et des PC. Les cellules répondant à CA-ERBB2 ont modifié l’expression de centaines de transcriptions distinctes. Nous nous sommes concentrés sur ces changements pour identifier les corrélats des effets indirects de l’expression CA-ERBB2 sur les cellules voisines.

3.5. Les cellules CA-ERBB2 expriment des gènes impliqués dans la modulation de la matrice extracellulaire

Une analyse d’enrichissement de l’ensemble génétique contre le processus biologique GO a été réalisée pour les gènes exprimés en amont des grappes S4 et S7 afin d’identifier les voies moléculaires répondant à l’activation ERBB2 (Figure 3D). Pour les autres clusters, les résultats avec les 10 principaux termes GO répertoriés avec q-valeur < 0,05 sont en Figure supplémentaire 6, et la liste complète des termes pour tous les clusters est fournie dans Tableau supplémentaire 6. Parmi les annotations les plus enrichies, toutes deux ajustées p-valeur et nombre de gènes impliqués, étaient des annotations de gènes liés à la modulation de l’ECM. Le cluster distinctif S4, formé entièrement par des cellules CA-ERBB2, a montré divers degrés d’activation des marqueurs impliqués dans l’organisation de la matrice extracellulaire ( GO: 0030198 ), et le démontage de la matrice extracellulaire ( GO: 0022617 ). Le cluster S4 avait également enrichi les gènes associés à la réponse cellulaire au stimulus cytokin ( GO: 0071345 ), voie de signalisation médiée par la cytokine ( GO: 0019221 ) et régulation de la voie de signalisation médiée par l’intégrine ( GO: 200101010101. Nous notons que les grappes S1 et S6 ont également été distinguées par des gènes exprimés impliqués dans l’organisation et le démontage de la matrice extracellulaire.

En ce qui concerne le cluster S7 distinctif des cellules CA-ERBB2, l’analyse du processus biologique GO n’a pas révélé de termes avec q-valeur < 0,05 (Figure 3D). Cependant, parmi les termes importants p-valeur ( < 0,05 ), sont des termes associés à des gènes Krt17 et Plet1 répertoriés comme DEG dans le test LR (Figure 3B et Tableau supplémentaire 4). Le développement de l’épiderme ( GO: 0008544 ) est associé à Krt17 et Col7a1 gènes. Ce terme est dans une relation parent-enfant avec le terme lié à la différenciation HC ( différenciation des cellules auditives de l’oreille interne, GO: 0042491 ). De plus, Plet1 est associé à la cicatrisation des plaies, à la propagation des cellules épidermiques ( GO: 0035313 et GO: 0044319 ), et à la régulation négative de l’adhérence à la matrice cellulaire ( GO: 0001953 ) (Tableau supplémentaire 6).

Dans les grappes S1, S2 et S6, les cellules CA-ERBB2 ont été mélangées avec des cellules de contrôle suggérant qu’elles ont un transcriptome similaire. Les termes GO identifiés pour ces groupes indiquent que les cellules cochléaires de souris P3 subissent toujours des changements liés au développement de l’organe de Corti (Figure supplémentaire 6). Par exemple, les cellules du groupe S1 ont été enrichies de gènes associés à la morphogenèse des organes sensoriels ( GO: 0090596 ), organisation de fibrilles de collagène ( GO: 0030199 ), régulation de la migration des cellules endothéliales ( GO: 001010594 : : 1010010101094 >, différenciation des cellules endodermiques ( GO: 0035987 ) et développement du système squelettique ( GO: 0001501 ). Dans le groupe S2, les cellules ont montré une régulation ascendante des gènes impliqués dans le développement des cellules épithéliales ( GO: 0002064 ), une régulation de la transcription impliquée dans l’engagement de devenir cellulaire ( GO: 0060850 ), et une voie de signalisation NOTCH ( GO:0007219 ). Dans le cluster S6, les gènes enrichis sont associés à la perception sensorielle du stimulus mécanique ( GO: 0050954 ), et à la perception sensorielle du son ( GO: 0007605 ).

Les cellules du cluster S8 ont été enrichies de termes associés à la division cellulaire. L’analyse des transcriptomes pour l’expression génique spécifique au cycle cellulaire a confirmé que les cellules du cluster S8 sont en phase S et G2 / M (Chiffres supplémentaires 6, 7). L’analyse a également révélé que, alors que la plupart des cellules à travers les conditions étaient en phase G1, les grappes S4 et S0 ont également montré un enrichissement des cellules en phase S et G2 / M, indiquant certaines cellules préparées ou ayant subi une division cellulaire (Figure supplémentaire 7). Dans le cluster S8, les cellules CA-ERBB2 et les cellules de contrôle ont montré des marqueurs pour les phases S et G2 / M, cependant, dans le cluster S0, cette population était principalement représentée par les cellules CA-ERBB2.

Ensemble, ces résultats indiquent que les changements transcriptionnels induits par les cellules CA-ERBB2 incluent le de novo expression des cytokines et des gènes de la voie de signalisation. Beaucoup devraient moduler la matrice extracellulaire et affecter la différenciation, favorisant la prolifération dans une minorité de cellules.

3.6. Les gènes les plus régulés dans les cellules CA-ERBB2 devraient former un réseau protéique qui module la signalisation extracellulaire

Comme l’un des objectifs de cette étude était d’identifier les voies de signalisation secondaires candidates qui pourraient agir en aval de la signalisation ERBB2, nous nous sommes concentrés ensuite sur la nouvelle population de cellules CA-ERBB2 qui formaient un cluster S4 transcriptionnellement distinct. Gènes à haut régulation Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1, se trouvent dans les annotations GO associées à la modulation de l’ECM et de la réponse à la cytokine (Figure 3D). À l’aide du logiciel STRING, nous avons analysé le réseau d’interaction protéine-protéine pour SPP1, TIMP1, MMP9 et DMP1. Les résultats sont visualisés dans Figures 4A – D, et les scores des interactions prévues sont résumés dans Tableau 1. L’analyse montre que les interactions entre SPP1, TIMP1, MMP9 et DMP1 ont des scores d’association dans la plage de confiance élevée et la plus élevée ( scores supérieurs à 0,7 et 0,9, respectivement ). L’augmentation du réseau de cinq protéines supplémentaires a révélé que le CD44 était une protéine étroitement associée (Figure 4B), avec le score de confiance le plus élevé ( supérieur à 0,9 ) calculé pour SPP1, TIMP1 et MMP9, indiquant des associations vrais probables. Cinq protéines supplémentaires ajoutées au réseau ont révélé deux protéines qui ont été trouvées comme étant différenciées entre CA-ERBB2 et les cellules de contrôle (Figure 4C). Ces protéines étaient CD63 et HPX, et les deux ont des scores d’association dans la plage de confiance la plus élevée ( au-dessus de 0,9 ) avec TIMP1; alors que HPX a également un score d’association dans la plage de confiance élevée ( supérieur à 0,7 ) avec MMP9.

SPP1 et DMP1 sont de petites glycoprotéines n-liées à liaison à l’intégrine ( SIBLING ), qui sont des ligands sécrétés pour les récepteurs CD44 et αvβ3 à l’intégrine. Ils favorisent la survie, la prolifération, la différenciation et la migration dans différents systèmes (Flores et al., 1992; Ashkar et al., 2000; Sodek et al., 2000; Denhardt et al., 2001; Jain et al., 2002; Karadag et al., 2005; Rangaswami et al., 2006; Kazanecki et al., 2007; Wu et al., 2011). TIMP1 inhibe MMP9, une métallopeptidase qui module les deux CD44 (Visse et Nagase, 2003; Grunwald et al., 2019) et signalisation NOTCH (Garg et al., 2010). Le récepteur CD44 a un rôle dans la survie cellulaire et la prolifération dans le développement du cancer, mais une découverte récente met également en évidence son rôle important dans la régénération tissulaire et la cicatrisation des plaies (Denhardt et al., 2001; Kyriakides et al., 2009; Kim et al., 2012; Michopoulou et al., 2020). Notamment, le CD44 est exprimé de manière endogène sur les OPC chez la souris à l’âge adulte (Hertzano et al., 2010).

Analyse des parcelles UMAP et violon divisé pour Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1 indique que la montée en puissance de ces gènes est observée dans les cellules CA-ERBB2 pour la plupart des grappes, avec un enrichissement significatif dans le cluster S4 (Figure 4E). Les cellules de contrôle expriment des niveaux inférieurs de Spp1 et Timp1 gènes, en particulier dans les grappes S1, S5 et S6. Pour les gènes Mmp9 et Dmp1, presque aucune expression n’est détectée dans les cellules de contrôle, à l’exception des grappes S9 et S5. Pour valider l’analyse scRNA-seq, nous avons effectué une réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcriptase inverse ( RT-qPCR ) sur des cellules GFP cochléaires triées FACS + collectées auprès de souris néonatales CA-ERBB2 et Control. Les résultats de l’analyse RT-qPCR sont présentés dans Figure 4F. Ils confirment que l’activation de la signalisation ERBB2 dans les cellules CA-ERBB2 a entraîné une expression significative régulée à la hausse des gènes Spp1, Timp1, Mmp9, et Dmp1, ainsi que d’autres gènes identifiés comme exprimés dans les cellules CA-ERBB2 du cluster S4 (Bglap, Bglap2, Ptgis, Cd63, Il12a, Anche) (Figure supplémentaire 8 et Figure 3C). Ces résultats confirment que le réseau de protéines SIBLING est en effet induit par l’expression CA-ERBB2 dans les SC au stade néonatal.

3.7. L’induction de la signalisation ERBB2 chez les souris adultes sourdes entraîne une régulation accrue Spp1 et Timp1, activation du récepteur CD44 et détection des agrégats cellulaires ectopiques dans le milieu scala cochléaire adulte

Déterminer si l’amas SIBLING pourrait être induit aux stades adultes, nous avons utilisé l’immunostatation sur des sections de cochlée de jeunes souris adultes après une combinaison de perte auditive induite par des dommages et d’induction de CA-ERBB2. Les jeunes souris mâles et femelles avec le génotype Control et CA-ERBB2 ont été exposées au bruit traumatique comme décrit dans les méthodes (Figure 5A). 3 jours après l’exposition au bruit ( 3 DPN ), les souris des deux génotypes ont été assignées au hasard à deux groupes et traitées avec une injection de doxycycline ( DOX ) pour initier l’expression CA-ERBB2; ou avec injection de solution saline à utiliser comme référence. Les souris ont été euthanasiées à 5 DPN, et leur cochlée a été disséquée et traitée pour immunostication avec des anticorps spécifiques au SPP1, au TIMP1 et au domaine intracellulaire du récepteur CD44.

Comme indiqué dans Figures 5B, C, SPP1 et TIMP1 ont été exprimés en sections cochléaires d’animaux CA-ERBB2 traités par DOX. L’immunoréactivité fluorescente pour SPP1 correspondait aux cellules GFP +, y compris les cellules proches de l’OHC qui correspondent au DC et les cellules proches de l’IHC correspondant aux cellules phalangiennes et aux cellules frontalières. De même, le TIMP1 a été détecté dans les cellules GFP +, bien que dans les sections des animaux témoins, l’immunoréactivité pour le TIMP1 était également évidente dans les cellules correspondant aux cellules phalangiennes internes et aux cellules frontalières. La coloration du domaine intracellulaire CD44 a montré une régulation clairement ascendante de la signalisation CD44 dans les cellules GFP + des animaux CA-ERBB2 traités par DOX. L’immunoréactivité CD44 a également été observée dans les cellules interphalangiennes, DC et également dans les cellules correspondant aux cellules HeC ou Claudius. Fait intéressant,L’activation du CD44 dans les cellules correspondant aux cellules HeC ou Claudius était également évidente dans les sections des animaux témoins. Ceci est cohérent avec le rapport précédent décrivant l’expression de CD44 pour augmenter le nombre de souris postnatales par P7 dans les OPC, les cellules de Claudius et dans un petit nombre de cellules GER (Hertzano et al., 2010).

Des souris supplémentaires exposées au bruit traumatique, à l’EdU et à la doxycycline ont été euthanasiées à 7 DPN et analysées pour l’expression GFP et des marqueurs supplémentaires (Figure 6). Nous avons constaté ici que les cellules GFP + et GFP négatives étaient situées dans le milieu scala de CA-ERBB2 cochlea. La phosphorylation de l’ERBB2 a été observée dans des cellules dispersées et n’a pas cartographié avec précision l’expression de GFP comme observé à des moments antérieurs (Zhang et al., 2018). Les chiffres mitotiques étiquetés avec EdU étaient évidents dans ces agrégats (Figure 6B ’), tout comme les cellules dispersées étiquetées avec CASP3 activé (Figure 6C ’). Cellules dispersées dans les agrégats exprimés des marqueurs sensoriels, y compris MYO7 (Figure 6B ’) et le marqueur SC TAK1 (Figure 6D ’). Ils étaient largement absents de SOX2 (Figure 6A ’) et PVALB (Figure 6D ’expression ). Certains agrégats avaient des régions multicellulaires lisses et compactées qui se collaient brillamment pour la phalloïdine. Des agrégats ont été observés dans quatre cochléés sur cinq avec induction CA-ERBB2. Dans 4 cochléaires témoins, seuls de très petits groupes de cellules ont été observés flottant dans le conduit cochléaire, dont aucun n’a exprimé de GFP ou incorporé EdU (Figures 6E, E ’, flèches ). Ces données sont cohérentes avec l’interprétation selon laquelle l’activation de la signalisation CA-ERBB2 chez les jeunes souris adultes après des dommages peut également induire l’expression de certains membres du réseau de protéines SIBLING. Ils suggèrent également que les SC tracés en lignée peuvent répondre à l’expression de CA-ERBB2 en sortant de l’épithélium.

4. Discussion

Auparavant, nous avons constaté que les SC avec une expression génique activée ERBB2 chez leurs voisins in vivo et a favorisé la différenciation des cellules semblables aux cellules ciliées, suggérant que ERBB2 peut initier une cascade de signalisation importante pour la régénération HC (Zhang et al., 2018). Ici, l’analyse du transcriptome unicellulaire a révélé la formation d’une nouvelle population parmi un sous-ensemble de cellules avec signalisation ERBB2 activée, qui s’était considérablement différenciée des cellules de contrôle parentales. Peut-être dérivées d’OPC, ces cellules expriment également des gènes spécifiques à LGER. Ils comprennent la plupart des cellules exprimant Spp1, identifié dans nos études comme l’un des gènes les plus activés en réponse à la signalisation ERBB2. Surtout, dans cette nouvelle population, nous voyons l’expression des trois autres gènes à régulation ascendante, Mmp9, Timp1, et Dmp1. Ensemble avec Spp1, ils sont associés à un réseau de signalisation impliquant des récepteurs CD44 et integrine αvβ3. L’analyse d’enrichissement GO a révélé que ces gènes modulent à la fois les réponses ECM et cytokine, y compris la signalisation Notch. Nous avons confirmé que les protéines SPP1, TIMP1 et CD44 sont également régulées à la hausse dans les SC cochléaires adultes après l’induction de CA-ERBB2. Par la suite, nous avons observé la formation d’agrégats flottants de cellules sensorielles cochléaires. Le sort et le potentiel de ces agrégats cellulaires ne sont pas connus.

SPP1 et DMP1 sont des glycoprotéines sécrétées qui agissent comme des ligands pour les récepteurs CD44 et αvβ3 d’intégrine. Ils sont membres de la petite famille de glycoprotéines n-liées au ligand de liaison à l’intégrine ( SIBLING ). SPP1 favorise la survie, la prolifération, la différenciation, l’adhésion et la migration de nombreux types de cellules (Flores et al., 1992; Ashkar et al., 2000; Sodek et al., 2000; Denhardt et al., 2001; Jain et al., 2002; Karadag et al., 2005; Rangaswami et al., 2006; Kazanecki et al., 2007). Bien que la fonction DMP1 dans les blessures et la cicatrisation des plaies n’ait pas encore été déterminée, elle est significativement régulée à la hausse dans un certain nombre de tissus cancéreux (Chaplet et al., 2003; Fisher et al., 2004). SPP1 peut fonctionner dans la différenciation neuronale des neurones auditifs pendant le développement de l’oreille interne (Kim et al., 2014). De plus, il est détecté dans le labyrinthe membraneux des cochléaires de mammifères adultes, en particulier dans l’utricule, où il est actuellement utilisé comme marqueur de type I HC (Lopez et al., 1995; Sakagami, 2000; McInturff et al., 2018; Jan et al., 2021).

L’aspect le plus important de la régulation ascendante des SPP1, MMP9 et TIMP1 en réponse à la signalisation ERBB2, c’est qu’ils favorisent la cicatrisation et la régénération des plaies après une blessure dans d’autres systèmes (Denhardt et al., 2001; Kyriakides et al., 2009; Kim et al., 2012; Michopoulou et al., 2020). SPP1 est bien connu pour arbitrer la régénération osseuse et musculaire (Uaesoontrachoon et al., 2008; Zanotti et al., 2011; Pagel et al., 2014; Maeda et al., 2017; Zhu et al., 2020), et il est également impliqué dans la promotion de la prolifération et de la régénération du système nerveux (Ellison et al., 1998; Hedtjarn et al., 2004; Liu et al., 2017). Dans des études récentes, Wang et al. a démontré que la liaison du SPP1 avec le CD44 et l’intégrine αvβ3 est importante dans la fonction des cellules de Schwann dans la régénération des nerfs, en favorisant la prolifération et la survie après une lésion nerveuse périphérique (Wang et al., 2020). Une autre étude de Powell et al. ( 2019 ) a montré que le SPP1 avec le MMP9 agit par le biais du récepteur CD44 pour arbitrer la synaptogenèse après l’insulte du système nerveux central ( CNS ).

TIMP1 est un inhibiteur de MMP9 et l’équilibre entre eux est un régulateur clé du réseau de signalisation dans le nerf blessé (Kim et al., 2012) et favorise le processus de guérison de la peau fœtale brûlée (Yu et al., 2017). La régulation ascendante de TIMP1 pourrait expliquer la régulation généralisée de SOX2 après la signalisation CA-ERBB2 in vivo (Zhang et al., 2018), car MMP9 est nécessaire pour la signalisation NOTCH (Zhao et al., 2016), et NOTCH est nécessaire et suffisant pour promouvoir l’expression SOX2 (Pan et al., 2013). Un rapport MMP9 / TIMP1 accru favorise la dégradation de l’ECM pour permettre la migration cellulaire, tandis qu’un rapport MMP9 / TIMP1 réduit stimule la reconstruction de l’ECM pendant le processus de guérison (Yu et al., 2017). TIMP1 peut également agir comme cytokine indépendamment de l’inhibition de MMP9 pour favoriser la survie et la prolifération des cellules (Ries, 2014). Dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, le TIMP1 favorise la migration, l’adhésion et la survie en se liant au complexe de récepteurs β1 à l’intégrine CD63 (Wilk et al., 2013). Notre analyse scRNA-seq a révélé le CD63 sous forme de DEG et sa régulation ascendante a été principalement enrichie en cluster S4 formé par des cellules CA-ERBB2 (Tableaux supplémentaires 3, 4).

La régulation à la hausse des SPP1, MMP9, TIMP1 et DMP1 en réponse à l’activation ERBB2 suggère que sa signalisation en aval implique un récepteur CD44 et potentiellement également des récepteurs d’intégration. La relation entre ERBB2 et CD44 a été décrite précédemment pour maintenir les interactions neuronales – cellules de Schwann dans le développement des nerfs néonataux précoces du rat (Sherman et al., 2000). En particulier, le CD44 a considérablement amélioré la phosphorylation ERBB2 induite par la néureguline et l’hétérodimérisation ERBB2 – ERBB3. Le CD44 s’est également révélé interagir avec le récepteur ERBB2 (Bourguignon et al., 1997; Sherman et al., 2000). L’importance du réseau des récepteurs CD44 dans la survie, la prolifération et la régénération des cellules décrites pour les cellules de Schwann et dans d’autres tissus suggère que certains des effets CA-ERBB2 impliquent la signalisation via le récepteur CD44.

Une flexibilité moindre de l’épithélium associé à la jonction cellule-cellule a été proposée comme l’un des mécanismes responsables de la diminution de la capacité de régénération de la cochlée de mammifère adulte (Burns et al., 2008). Nos résultats indiquent que la signalisation ERBB2 favorise la modulation de l’ECM qui permettrait une flexibilité accrue dans l’organe de Corti. La combinaison d’inhibiteurs de l’EGF et de la GSK3 a récemment été signalée comme appauvrissant la cajérine E dans des jonctions serrées de la cochlée de mammifères adultes (Kozlowski et al., 2020). En plus des gènes régulés à la hausse associés au démontage ECM dans le cluster S4, il existe également une régulation à la hausse Plet1 gène dans les cellules CA-ERBB2 du cluster S7, qui est associé à une régulation négative de l’adhérence à matrice cellulaire ( GO: 0001953 ). Plet1est répertorié en termes GO associés à la propagation des cellules et à la cicatrisation des plaies ( GO: 0035313, GO: 0044319 ). Ainsi, nous prédisons que sa régulation ascendante permettrait une augmentation des mouvements locaux de cellules.

L’importance de la modulation ECM médiée par ERBB2 pour la régénération des HC est également soutenue par des études récentes indiquant que les récepteurs ECM et d’intégrine sont induits dans le développement neurosensoriel précoce et la détermination du devenir cellulaire dans le fœtus humain oreille interne (Johnson Chacko et al., 2021). Nous spéculons que l’activation forcée des voies de signalisation à travers les récepteurs de la famille ERBB pourrait permettre des changements dans l’environnement de l’organe de Corti qui favorisent la prolifération des SC et permettent la régénération des HC. Des études antérieures ont montré peu ou pas d’activité des cellules souches chez la cochlée de mammifères adultes (Oshima et al., 2007; Senn et al., 2020). Cela contraste avec la capacité robuste en forme de tige dans les cellules isolées de l’utricule adulte (Li et al., 2003; Senn et al., 2020), qui est en corrélation avec un potentiel de régénération limité dans cet organe (Burns and Stone, 2017). Ces données peuvent être interprétées comme signifiant que les cellules souches cochléaires, résidant peut-être dans le RGO (Udagawa et al., 2021), sont perdus pendant la maturation. Il est également possible que leurs exigences de survie ou de maintien de l’identité diffèrent. Par exemple, ils peuvent nécessiter des cellules accessoires pour maintenir leur niche microenvironnementale. Alternativement, l’expression forcée de la signalisation CA-ERBB2 pourrait promouvoir de nouveaux comportements non visibles autrement dans les SC cochléaires.

En conclusion, nous rapportons que la signalisation forcée d’ERBB2 dans une minorité de SC cochléaires entraîne une nouvelle réponse de différenciation dans la cochlée de souris néonatale. Ces cellules induisent l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans la signalisation, la cicatrisation des plaies et la migration. Nous confirmons qu’au moins deux de ces gènes, SPP1 et CD44, sont également régulés à la hausse dans les cellules cochléaires adultes après l’induction de CA-ERBB2. L’induction CA-ERBB2 est également en corrélation avec la génération d’agrégats cellulaires dans le conduit cochléaire. Ces agrégats contiennent, mais sans s’y limiter, des cellules CA-ERBB2 cartographiées par le devenir. Leur potentiel, leurs effets et leur sort restent à déterminer.

Déclaration de disponibilité des données

Les données présentées dans cette étude sont déposées dans le référentiel de données Gene Expression Omnibus, numéro d’accès: GSE202850 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE202850). Les données d’image disponibles à partir de: https://osf.io/r9cbq/.

Énoncé d’éthique

Cette étude sur les animaux a été examinée et approuvée par le Bureau d’examen des soins et de l’utilisation des animaux, Département de la défense, et le Comité universitaire de recherche sur les animaux, Université de Rochester.

Contributions d’auteur

DP-P: administration de projet, enquête, méthodologie, conservation des données, analyse formelle, visualisation, rédaction – ébauche et révision originales et édition. DN et CB: conservation des données, analyse formelle, logiciel, visualisation et révision et édition –. JZ: méthodologie, enquête, visualisation et rédaction – examen et édition. JA: conceptualisation, supervision, ressources et rédaction – examen et édition. PW: conceptualisation, acquisition de financement, ressources, supervision, analyse formelle et révision et édition de –. Tous les auteurs ont contribué à l’article et approuvé la version soumise.

Financement

Ce travail a été financé par les États-Unis. Mécanisme de recherche médicale de l’armée ( W81XWH2010515 ) ( numéro de subvention: RH190035 ), Institut national sur la surdité et les autres troubles de la communication ( numéros de subvention: R01 DC014261 et R01 DC018660 ) et le programme Schmitt sur les neurosciences intégratives.

Remerciements

Nous reconnaissons avec reconnaissance le Dr. Anne Luebke, qui possède le noyau de test auditif pour petits animaux de l’URMC; Dr. Jian Zuo pour la souche de souris Fgfr3-iCre; Dr. Lin Gan pour la souche de souris rtTA / GFP floxed ROSA; et Dr. Amy Kiernan pour des conseils sur l’interprétation expérimentale et pour la lecture critique du manuscrit.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Note de l’éditeur

Toutes les affirmations exprimées dans cet article sont uniquement celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement celles de leurs organisations affiliées, ni celles de l’éditeur, des rédacteurs en chef et des examinateurs. Tout produit qui peut être évalué dans cet article, ou allégation qui peut être faite par son fabricant, n’est pas garanti ou approuvé par l’éditeur.

Matériel supplémentaire

Le matériel supplémentaire de cet article peut être consulté en ligne sur: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2022.1096872/full#supplementary-material

Notes de bas de page

1. ^ http://geneontology.org/
2. ^ http://string-db.org

Références